ヒト胎生期神経幹細胞の特異性表出機構の解明とその応用によるマウス神経幹細胞ヒト化

阐明人胚胎神经干细胞特异性表达机制及其应用对小鼠神经干细胞的人源化

基本信息

批准号：
22KJ2469
负责人：
中川拓海
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2469/
关键词：
大脳皮質発生神経幹細胞 CRISPR/Cas9 エピゲノム

项目摘要

CRISPR/Cas9 スクリーニングの次世代シーケンス（NGS）データを用いて、ノックアウト（KO）されることで神経幹細胞がニューロンに早期分化する遺伝子を探索した。続いて、解析の結果得られた遺伝子のうち、公共遺伝子発現データを元にして、胎生期神経幹細胞においてヒトでマウスより発現量の高い遺伝子に絞り込んだ。絞り込んだ候補遺伝子のうち、ヒト・マウス神経幹細胞間での発現量の差が有意であった数遺伝子の発現を、ヒトiPS細胞由来神経幹細胞（AF22）で減弱させ、AF22が早期に増殖を止めニューロンに分化するようになるのかをクローナル解析を行い検討した。その結果、遺伝子Xを標的とするshRNAを発現させたときに、著しいクローン数の減少が見られたため、以降の実験では遺伝子Xに焦点を当てることとした。続いて、遺伝子Xの発現をAF22で減弱後に分化誘導し、免疫染色を行ってニューロンへの分化能の評価を行った。結果、遺伝子Xの発現を減弱させたAF22は、コントロールよりもより多くのニューロンを産生していた。以上の結果から、遺伝子Xはヒト神経幹細胞が未分化性を維持し、長期間ニューロンを産生することができるという機能において重要な役割を担っていると考えられた。今後は、遺伝子Xがどのようにヒト神経幹細胞の長期間のニューロン産生を可能にしているのか、そのメカニズムを明らかにしていく。そのためにまず、遺伝子Xの発現を減弱させたAF22でRNA-seqを行い、発現が変動した遺伝子群を同定することにより、遺伝子Xがどのような遺伝子発現を制御しているのかを調べる予定である。また、胎生期マウス神経幹細胞において遺伝子Xを過剰発現することで、その増殖やニューロン産生期間の延長が観察されるかどうかも調べる予定である。

使用CRISPR/CAS9筛选的下一代测序（NGS）数据用于搜索使神经干细胞被敲除（KO）以过早区分神经元的基因。接下来，根据分析获得的基因，基于公共基因表达数据，将基因缩小到人类胚胎神经干细胞中表达水平较高的基因而不是小鼠中的基因。在狭窄的候选基因中，人IPS衍生的神经干细胞（AF22）减弱了几种基因的表达，它们在人和小鼠神经干细胞之间存在显着差异，我们研究了AF22是否会停止增殖并在早期阶段分化为神经元。结果，当表达shRNA靶向基因X时，观察到克隆数量的显着减少，在以下实验中，我们决定关注基因X。随后，随后，基因X的表达用AF22减弱，并诱导了差异化，并进行了免疫抑制作用，以评估分化为神经元的能力。结果，减弱基因X表达的AF22产生的神经元比对照组更多。从以上结果来看，人们认为基因X在人类神经干细胞的功能中起着重要作用，在保持其不体分化并能够长时间产生神经元中起着重要作用。将来，我们将阐明基因X如何允许人类神经干细胞的神经元产生的机制。为此，我们将首先使用AF22执行RNA-SEQ，这使Gene X的表达减弱，并识别具有不同表达的基因，以确定Gene X调控了哪些基因表达。我们还将研究Gene X在胚胎小鼠神经细胞中是否过表达，这将导致神经元生产时期的繁殖和延长。