急速凍結-低温電子顕微鏡法によるナトリウムポンプの高次構造の研究

本研究は、ナトリウムポンプの高次構造を明らかにすることが目標であったが、部分的にではあるが達成できた。本研究では金粒子ラベルしたリガンドを用い、リガンド結合サイトを決定することも目標であったが、金粒子ラベルを導入する以前に分子の構造の概要を明らかにするため、2次元結晶を形成しているナトリウムポンプ分子の構造解析を行った。ナトリウムポンプ2次元結晶を電子顕微鏡観察用グリッド上で急速凍結したものを低温電子顕微鏡で観察し、2次元結晶像の解析用プログラムで解析した。しかし、2次元結晶格子の種々の乱れにより、解析結果の分解能が向上せず、ナトリウムポンプ分子に相当する密度の形も不自然であった。そこで、新しい試みとして2次元結晶像の解析に単分子解析法を導入したところ分解能が11オングストロームまで向上し、密度の形も以前発表したものと矛盾なく解釈でき、より詳細の見て取れるものとなった(Journal of Electron Microscopy第49巻に発表)。その結果、隣の分子との相互作用が存在することは分かったが、それが二量体かより多量体かは判然としない。そこで、立体像再構成のため、可溶化分子の観察を行い解析を開始した。解析途中では、単量体と二量体と考えられる分子が観察されていたが、個々の分子の空間的な方位を決定することが極めて難しいことから、まず膜結合型ナトリウムポンプを観察することに方針を変更せざるを得なかった。現在予備研究として、酢酸ウラニル染色した膜結合型ナトリウムポンプを観察・立体再構成している。これに急速凍結-低温電顕法によって観察した膜結合型ナトリウムポンプのデータを加えてゆき、既に撮影した可溶化分子のデータを加えれば完全な3次元構造が明らかになり、さらに金粒子ラベルによりリガンド結合サイトも明らかになる。

本研究は、ナトリウムポンプの高次構造を明らかにすることが目標であったが、部分的にではあるが達成できた。本研究では金粒子ラベルしたリガンドを用い、リガンド結合サイトを決定することも目標であったが、金粒子ラベルを導入する以前に分子の構造の概要を明らかにするため、2次元結晶を形成しているナトリウムポンプ分子の構造解析を行った。ナトリウムポンプ2次元結晶を電子顕微鏡観察用グリッド上で急速凍結したものを低温電子顕微鏡で観察し、2次元結晶像の解析用プログラムで解析した。しかし、2次元結晶格子の種々の乱れにより、解析結果の分解能が向上せず、ナトリウムポンプ分子に相当する密度の形も不自然であった。そこで、新しい試みとして2次元結晶像の解析に単分子解析法を導入したところ分解能が11オングストロームまで向上し、密度の形も以前発表したものと矛盾なく解釈でき、より詳細の見て取れるものとなった(Journal of Electron Microscopy第49巻に発表)。その結果、隣の分子との相互作用が存在することは分かったが、それが二量体かより多量体かは判然としない。そこで、立体像再構成のため、可溶化分子の観察を行い解析を開始した。解析途中では、単量体と二量体と考えられる分子が観察されていたが、個々の分子の空間的な方位を決定することが極めて難しいことから、まず膜結合型ナトリウムポンプを観察することに方針を変更せざるを得なかった。現在予備研究として、酢酸ウラニル染色した膜結合型ナトリウムポンプを観察・立体再構成している。これに急速凍結-低温電顕法によって観察した膜結合型ナトリウムポンプのデータを加えてゆき、既に撮影した可溶化分子のデータを加えれば完全な3次元構造が明らかになり、さらに金粒子ラベルによりリガンド結合サイトも明らかになる。