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急速凍結-低温電子顕微鏡法によるナトリウムポンプの高次構造の研究

快速冷冻冷冻电镜研究钠泵高阶结构

基本信息

批准号：
11780477
负责人：
田原義和
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyorin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、ナトリウムポンプの高次構造を明らかにすることが目標であったが、部分的にではあるが達成できた。本研究では金粒子ラベルしたリガンドを用い、リガンド結合サイトを決定することも目標であったが、金粒子ラベルを導入する以前に分子の構造の概要を明らかにするため、2次元結晶を形成しているナトリウムポンプ分子の構造解析を行った。ナトリウムポンプ2次元結晶を電子顕微鏡観察用グリッド上で急速凍結したものを低温電子顕微鏡で観察し、2次元結晶像の解析用プログラムで解析した。しかし、2次元結晶格子の種々の乱れにより、解析結果の分解能が向上せず、ナトリウムポンプ分子に相当する密度の形も不自然であった。そこで、新しい試みとして2次元結晶像の解析に単分子解析法を導入したところ分解能が11オングストロームまで向上し、密度の形も以前発表したものと矛盾なく解釈でき、より詳細の見て取れるものとなった(Journal of Electron Microscopy第49巻に発表)。その結果、隣の分子との相互作用が存在することは分かったが、それが二量体かより多量体かは判然としない。そこで、立体像再構成のため、可溶化分子の観察を行い解析を開始した。解析途中では、単量体と二量体と考えられる分子が観察されていたが、個々の分子の空間的な方位を決定することが極めて難しいことから、まず膜結合型ナトリウムポンプを観察することに方針を変更せざるを得なかった。現在予備研究として、酢酸ウラニル染色した膜結合型ナトリウムポンプを観察・立体再構成している。これに急速凍結-低温電顕法によって観察した膜結合型ナトリウムポンプのデータを加えてゆき、既に撮影した可溶化分子のデータを加えれば完全な3次元構造が明らかになり、さらに金粒子ラベルによりリガンド結合サイトも明らかになる。

This study is aimed at improving the quality of high-order structures. In this study, the molecular structure of gold particles was summarized and analyzed before the introduction of gold particles. The analysis of 2D crystal images is carried out by electron microscopy at low temperatures. The decomposition energy of the two-dimensional crystal lattice can be increased, and the density of the molecule is not natural. A new method of molecular analysis for the analysis of 2D crystallographic images was introduced. The decomposition energy was 11 times higher than that of the previous generation, and the density of the crystal was 11 times higher than that of the previous generation.(Journal of Electron Microscopy, Section 49). As a result, the interaction between neighboring molecules exists. The analysis of soluble molecules begins. In the process of analysis, the molecule is detected in the middle of the molecule, and the molecular orientation is determined. Now, we are going to study the structure of the film by using the dye and the three-dimensional reconstruction. The rapid freeze-low temperature electrochemistry method is used to detect the membrane bonding type, the soluble molecule bonding type and the gold particle bonding type.