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オンチップ迅速核酸増幅-免疫FET検出によるPOCT多項目診断バイオセンサの開発

利用片上快速核酸扩增-免疫FET检测开发POCT多项目诊断生物传感器

基本信息

批准号：
22KJ2239
负责人：
繁森弘基
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、細菌・古細菌の獲得免疫機構として知られるCRISPR/Cas12システムが標的遺伝子に対して迅速かつ特異的に認識し、同時にssDNA切断を応用した信号変換を行うことに着目した。そして、CRISPR分子(Cas12及びssDNA)をマイクロ流路やFET等の電極センサアレイ上に修飾した迅速病原微生物同定技術の実現を目指す。本年度は研究開発の概念実証として、①Cas12及びssDNAレポーターを修飾した表面におけるコラテラル切断反応の確認、②Cas12/ssDNA修飾表面を利用したワンポット多項目dsDNA検出の検討、③アレイ集積化を指向したCRISPR試薬のスポッティング法の検討に着手した。①においては、まず基板表面に対するCas12の化学修飾方法を数種類比較し、最も高いコラテラル切断活性を示す条件で修飾方法を最適化した。この基板表面に対して、蛍光標識したssDNAレポーターも同時に修飾し、固相系コラテラル切断型dsDNAセンサを開発した。実際、本センサ上に標的dsDNAを添加したところ、コラテラル切断由来の蛍光減少が計測できた。②においては、上記のCas12/ssDNAレポーター修飾表面を2つのスポットにパターン化し、2種類の標的dsDNAの識別を試みた。サンプル中にスポットが標的とするdsDNAが含まれている場合は、スポット蛍光強度が40～60%程度減少した。一方、標的配列とは異なるdsDNAが含まれている場合において、スポット蛍光強度はdsDNA非存在条件と比較してほとんど減少しなかった。以上のことから、本センサを使用したワンポット多項目dsDNA検出が立証された。また、配列特異性は2塩基レベルであった。本年度後半より、検出項目数の増加を目的として③に取り組み、CRISPR試薬の吐出及び修飾条件を検討中である。

This study aims to identify the immune mechanisms of bacteria and archaea and to identify CRISPR/Cas12 genes that can be used to identify specific genes, and to identify the signal transduction mechanisms for ssDNA cleavage. CRISPR molecules (Cas12 and ssDNA) are used to modify electrodes such as flow paths and FETs to achieve rapid identification of pathogenic microorganisms. This year, we will study the concept of development,(1) confirmation of Cas12 and ssDNA modification,(2) evaluation of Cas12/ssDNA modification,(3) evaluation of CRISPR modification, and (4) evaluation of Cas12/ssDNA modification. (1) To compare several kinds of chemical modification methods for Cas12 on the surface of the substrate, and to optimize the modification method under the conditions of high temperature and high activity. The surface of the substrate is exposed to light, and the ssDNA is simultaneously modified and the solid phase is exposed to light. In fact, the target dsDNA is added to the system, and the source of the light is measured. 2. The Cas12/ssDNA modified surface is tested for identification of 2 kinds of target dsDNA. In the case of dsDNA, the intensity of light decreases by 40~60%. The light intensity of dsDNA is not the same as that of dsDNA. The above results are supported by the use of multi-item dsDNA detection. 2-fold. In the second half of the year, the number of detected items increased, and the selection group, CRISPR test product output and modification conditions were discussed.