オンチップ迅速核酸増幅-免疫FET検出によるPOCT多項目診断バイオセンサの開発

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本研究は、細菌・古細菌の獲得免疫機構として知られるCRISPR/Cas12システムが標的遺伝子に対して迅速かつ特異的に認識し、同時にssDNA切断を応用した信号変換を行うことに着目した。そして、CRISPR分子(Cas12及びssDNA)をマイクロ流路やFET等の電極センサアレイ上に修飾した迅速病原微生物同定技術の実現を目指す。本年度は研究開発の概念実証として、①Cas12及びssDNAレポーターを修飾した表面におけるコラテラル切断反応の確認、②Cas12/ssDNA修飾表面を利用したワンポット多項目dsDNA検出の検討、③アレイ集積化を指向したCRISPR試薬のスポッティング法の検討に着手した。①においては、まず基板表面に対するCas12の化学修飾方法を数種類比較し、最も高いコラテラル切断活性を示す条件で修飾方法を最適化した。この基板表面に対して、蛍光標識したssDNAレポーターも同時に修飾し、固相系コラテラル切断型dsDNAセンサを開発した。実際、本センサ上に標的dsDNAを添加したところ、コラテラル切断由来の蛍光減少が計測できた。②においては、上記のCas12/ssDNAレポーター修飾表面を2つのスポットにパターン化し、2種類の標的dsDNAの識別を試みた。サンプル中にスポットが標的とするdsDNAが含まれている場合は、スポット蛍光強度が40～60%程度減少した。一方、標的配列とは異なるdsDNAが含まれている場合において、スポット蛍光強度はdsDNA非存在条件と比較してほとんど減少しなかった。以上のことから、本センサを使用したワンポット多項目dsDNA検出が立証された。また、配列特異性は2塩基レベルであった。本年度後半より、検出項目数の増加を目的として③に取り組み、CRISPR試薬の吐出及び修飾条件を検討中である。