立体的ヒストンコードによる新たな遺伝子発現制御

通过空间组蛋白密码控制新的基因表达

基本信息

批准号：
22KJ2348
负责人：
花木駿介
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Yamaguchi University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2348/
关键词：
プロリン異性化ヒストン

项目摘要

本年度はプロリン異性化酵素FKBP52(FK506 Binding Protein 52)がヒストンH3のプロリン残基を異性化するか検証した。プロリンの異性化を検出する方法として、キモトリプシン法の構築を行なった。最初にキモトリプシン法に用いるヒストンペプチドの合成を行った。FKBP52が異性化すると推測されるプロリン残基までは通常のペプチド配列を合成し、直後にフェニルアラニンとペプチジル-パラニトロアニリンを融合させた。合成ペプチドはプロリン残基が異性化されることによりキモトリプシンによりペプチジル-パラニトロアニリンが遊離し吸光度が上昇する。FKBP52を添加することで、吸光度が増加したことから、FKBP52はヒストンペプチドを異性化することが分かった。FKBP52の酵素活性を欠損させた変異体では吸光度は変化しなかったことから、FKBP52の酵素活性依存的にヒストンペプチドを異性化していることが明らかになった。加えて、FKBP52の異性化が基質のリン酸化状態に依存しているか探索するために、リン酸化・非リン酸化ペプチドを合成した。プロリン異性化酵素が活性を発揮するためには、特定の条件が必要となることが多い。代表的なプロリン異性化酵素であるPin1は、標的となるプロリンの直前に位置するセリン、スレオニンのリン酸化が異性化を惹起するための前提条件となっている。FKBP52によるプロリンの異性化に対しても近傍のリン酸化が目印となって作用する可能性を検証するために、リン酸化・非リン酸化ペプチドを合成し、アッセイ系を構築した。

今年，我们研究了脯氨酸异构酶FKBP52（FK506结合蛋白52）是否会使组蛋白H3的脯氨酸残基异构化。构建了胰凝乳蛋白酶方法作为检测脯氨酸异构化的方法。首先，合成了胰凝乳蛋白酶法中使用的组蛋白肽。将正常的肽序列合成至脯氨酸残基，该残基被认为是由FKBP52异构的，然后立即将苯丙氨酸和肽基 - 丙烷氨基氨酸融合。在合成肽中，脯氨酸残基被异构化，从而导致胰凝乳蛋白酶释放出肽基 - 丙酰氨基氨氨和增加的吸光度。 FKBP52的添加增加了吸光度，发现FKBP52与组蛋白肽异构化。在缺乏FKBP52酶活性的突变体中，吸光度没有改变，这表明组蛋白肽在FKBP52的酶活性的依赖性中被异构。另外，合成磷酸化和非磷酸化的肽，以探索FKBP52的异构化是否取决于底物的磷酸化状态。为了使脯氨酸异构酶活跃，通常需要特定条件。 PIN1是一种典型的脯氨酸异构酶，是位于靶脯氨酸之前的丝氨酸和苏氨酸磷酸化的先决条件，以诱导异构化。为了验证附近的磷酸化还可以作为反对FKBP52异构化的标志物，合成了磷酸化和非磷酸化的肽，并构建了测定系统。