Elucidating novel pathological mechanisms of lung fibrosis using the anti-fibrotic drug as molecular probes

本年度は、あらかじめ合成済みであったピルフェニドン類縁体プローブを用いて、ピルフェニドンの標的因子を捕捉するための実験系の確立を行った。プローブには反応性の異なる2つのアジド基が含まれており、それらをそれぞれ標的とのクロスリンク、精製のためのクリック反応に用いる。当初はヒト肺線維芽細胞の抽出液中において、紫外線の照射によるプローブと標的との結合反応を行うことを考えていたが、合成したプローブの反応性の高さと反応特異性を考慮し、生細胞内にプローブを直接添加することによる標識反応について検討した。確立した反応系によりピルフェニドンの標的因子をラベルした後、磁気ビーズを用いたクリック反応による標的分子の精製と濃縮を行い、質量分析によるピルフェニドンの標的タンパク質群の網羅的な同定解析を行った。プローブに類似した分子を用いた競合阻害の有無を指標とし、得られた標的候補の中から統計的解析によりピルフェニドンと強く相互作用することが考えられる有望な候補因子を絞り込んだ。現在、これらについてリコンビナントタンパク質の発現ベクターを作製しており、これをHEK293T細胞で強制発現させてプローブと反応させることにより、ピルフェニドンとの結合性について再検証を行っている。現在、ピルフェニドンとの相互作用が確認できた分子が得られており、培養細胞や動物モデルを用いてピルフェニドンの標的因子が線維化に与える影響について解析を行っている。

本年度は、あらかじめ合成済みであったピルフェニドン類縁体プローブを用いて、ピルフェニドンの標的因子を捕捉するための実験系の確立を行った。プローブには反応性の異なる2つのアジド基が含まれており、それらをそれぞれ標的とのクロスリンク、精製のためのクリック反応に用いる。当初はヒト肺線維芽細胞の抽出液中において、紫外線の照射によるプローブと標的との結合反応を行うことを考えていたが、合成したプローブの反応性の高さと反応特異性を考慮し、生細胞内にプローブを直接添加することによる標識反応について検討した。確立した反応系によりピルフェニドンの標的因子をラベルした後、磁気ビーズを用いたクリック反応による標的分子の精製と濃縮を行い、質量分析によるピルフェニドンの標的タンパク質群の網羅的な同定解析を行った。プローブに類似した分子を用いた競合阻害の有無を指標とし、得られた標的候補の中から統計的解析によりピルフェニドンと強く相互作用することが考えられる有望な候補因子を絞り込んだ。現在、これらについてリコンビナントタンパク質の発現ベクターを作製しており、これをHEK293T細胞で強制発現させてプローブと反応させることにより、ピルフェニドンとの結合性について再検証を行っている。現在、ピルフェニドンとの相互作用が確認できた分子が得られており、培養細胞や動物モデルを用いてピルフェニドンの標的因子が線維化に与える影響について解析を行っている。