Elucidating novel pathological mechanisms of lung fibrosis using the anti-fibrotic drug as molecular probes

以抗纤维化药物为分子探针阐明肺纤维化的新病理机制

• 批准号: 22KJ1552
• 负责人: 竹内 大修
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1552/
• 关键词: 肺線維症; 標的探索; 質量分析; ピルフェニドン; クリックケミストリー; AP-MS

本年度は、あらかじめ合成済みであったピルフェニドン類縁体プローブを用いて、ピルフェニドンの標的因子を捕捉するための実験系の確立を行った。プローブには反応性の異なる2つのアジド基が含まれており、それらをそれぞれ標的とのクロスリンク、精製のためのクリック反応に用いる。当初はヒト肺線維芽細胞の抽出液中において、紫外線の照射によるプローブと標的との結合反応を行うことを考えていたが、合成したプローブの反応性の高さと反応特異性を考慮し、生細胞内にプローブを直接添加することによる標識反応について検討した。確立した反応系によりピルフェニドンの標的因子をラベルした後、磁気ビーズを用いたクリック反応による標的分子の精製と濃縮を行い、質量分析によるピルフェニドンの標的タンパク質群の網羅的な同定解析を行った。プローブに類似した分子を用いた競合阻害の有無を指標とし、得られた標的候補の中から統計的解析によりピルフェニドンと強く相互作用することが考えられる有望な候補因子を絞り込んだ。現在、これらについてリコンビナントタンパク質の発現ベクターを作製しており、これをHEK293T細胞で強制発現させてプローブと反応させることにより、ピルフェニドンとの結合性について再検証を行っている。現在、ピルフェニドンとの相互作用が確認できた分子が得られており、培養細胞や動物モデルを用いてピルフェニドンの標的因子が線維化に与える影響について解析を行っている。

This year は, あ ら か じ め synthetic 済 み で あ っ た ピ ル フ ェ ニ ド ン class try body プ ロ ー ブ を with い て, ピ ル フ ェ ニ ド ン の underlying factor を capture す る た め の be 験 line is の established を っ た. プ ロ ー ブ に は anti 応 sex の different な る 2 つ の ア ジ ド base が containing ま れ て お り, そ れ ら を そ れ ぞ れ mark と の ク ロ ス リ ン ク, refined の た め の ク リ ッ ク anti 応 に with い る. Original は ヒ ト lung line d の bud cells in the extract に お い て, の exposure to the sun's ultraviolet rays に よ る プ ロ ー ブ と mark と の combined anti 応 を line う こ と を exam え て い た が, synthetic し た プ ロ ー ブ の anti 応 の high さ と 応 specificity を consider し, living cells に プ ロ ー ブ を added directly す る こ と に よ る identity against 応 に つ い て beg し 検 た. Establish し た anti 応 department に よ り ピ ル フ ェ ニ ド ン の underlying factor を ラ ベ ル し た after, magnetic 気 ビ ー ズ を with い た ク リ ッ ク anti 応 に よ る target molecules の refined と enrichment を い, quality analysis に よ る ピ ル フ ェ ニ ド ン の mark タ ン パ ク mass group of な の snare set analytical を row っ た. を プ ロ ー ブ に similar し た molecules with い resistance against の た phenomenon in presence of を index と し, ら れ た mark in the alternate の か ら statistical parsing に よ り ピ ル フ ェ ニ ド ン と strong く interaction す る こ と が exam え ら れ る could な alternate factor を ground り 込 ん だ. Now, こ れ ら に つ い て リ コ ン ビ ナ ン ト タ ン パ ク qualitative の 発 now ベ ク タ ー を cropping し て お り, こ れ を HEK293T cells で forced 発 now さ せ て プ ロ ー ブ と anti 応 さ せ る こ と に よ り, ピ ル フ ェ ニ ド ン と の associativity に つ い て 検 again line card を っ て い る. Now, ピ ル フ ェ ニ ド ン と の interaction が confirm で き た molecules are が ら れ て お り, culture cell や animal モ デ ル を with い て ピ ル フ ェ ニ ド ン の が line dimensions underlying factor に and え る influence に つ い て parsing line を っ て い る.

项目成果

肺線維症治療薬ピルフェニドンの標的分子群の同定解析

肺纤维化药物吡非尼酮靶分子的鉴定与分析

• 发表时间: 2023
• 作者: 竹内大修;山本雪乃;横島聡;辰川英樹;人見清隆
• 通讯作者: 人見清隆