細菌におけるカチオン性抗菌ペプチド検知機構の解明

事前実験より、大腸菌において安定なヒスチジンキナーゼ/ABC輸送体複合体として発現されることが確認されたBacillus subtilis由来のヒスチジンキナーゼBceSおよびABC輸送体BceABについて、大スケールでの大量発現による精製方法を模索した。その結果、GFP-Nanobodyレジンを用いた、ヒスチジンキナーゼBceSに付加したGFPタグに対するアフィニティー精製が手法として適していると判断された。ここで、GFPタグはTEVプロテアーゼ切断配列を介してBceSのC末端側に付加されており、TEVプロテアーゼを用いた切断により目的産物であるBceS/BceAB複合体がGFP-Nanobodyレジンから溶出される。しかし、現状のプロトコルではタグ切断による目的産物の溶出量が構造解析には不十分であると考えられたため、プロテアーゼ切断配列の検討等によるコンストラクトの最適化、およびタグ切断に使用するプロテアーゼ量の検討等による精製手法の最適化を行った。現在コンストラクトとしてはTEVプロテアーゼによる十分なタグ切断が確認されたため、今後は引き続き精製手法の最適化を行い、構造解析に十分な量の安定なBceS/BceAB複合体を調製する精製系の確立を目指す。

事前実験より、大腸菌において安定なヒスチジンキナーゼ/ABC輸送体複合体として発現されることが確認されたBacillus subtilis由来のヒスチジンキナーゼBceSおよびABC輸送体BceABについて、大スケールでの大量発現による精製方法を模索した。その結果、GFP-Nanobodyレジンを用いた、ヒスチジンキナーゼBceSに付加したGFPタグに対するアフィニティー精製が手法として適していると判断された。ここで、GFPタグはTEVプロテアーゼ切断配列を介してBceSのC末端側に付加されており、TEVプロテアーゼを用いた切断により目的産物であるBceS/BceAB複合体がGFP-Nanobodyレジンから溶出される。しかし、現状のプロトコルではタグ切断による目的産物の溶出量が構造解析には不十分であると考えられたため、プロテアーゼ切断配列の検討等によるコンストラクトの最適化、およびタグ切断に使用するプロテアーゼ量の検討等による精製手法の最適化を行った。現在コンストラクトとしてはTEVプロテアーゼによる十分なタグ切断が確認されたため、今後は引き続き精製手法の最適化を行い、構造解析に十分な量の安定なBceS/BceAB複合体を調製する精製系の確立を目指す。