細菌におけるカチオン性抗菌ペプチド検知機構の解明

阐明细菌中阳离子抗菌肽的检测机制

• 批准号: 22KJ1017
• 负责人: 西村 方博
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ1017/
• 关键词: カチオン性抗菌ペプチド; ヒスチジンキナーゼ; 二成分制御系; ABC輸送体; クライオ電子顕微鏡

事前実験より、大腸菌において安定なヒスチジンキナーゼ/ABC輸送体複合体として発現されることが確認されたBacillus subtilis由来のヒスチジンキナーゼBceSおよびABC輸送体BceABについて、大スケールでの大量発現による精製方法を模索した。その結果、GFP-Nanobodyレジンを用いた、ヒスチジンキナーゼBceSに付加したGFPタグに対するアフィニティー精製が手法として適していると判断された。ここで、GFPタグはTEVプロテアーゼ切断配列を介してBceSのC末端側に付加されており、TEVプロテアーゼを用いた切断により目的産物であるBceS/BceAB複合体がGFP-Nanobodyレジンから溶出される。しかし、現状のプロトコルではタグ切断による目的産物の溶出量が構造解析には不十分であると考えられたため、プロテアーゼ切断配列の検討等によるコンストラクトの最適化、およびタグ切断に使用するプロテアーゼ量の検討等による精製手法の最適化を行った。現在コンストラクトとしてはTEVプロテアーゼによる十分なタグ切断が確認されたため、今後は引き続き精製手法の最適化を行い、構造解析に十分な量の安定なBceS/BceAB複合体を調製する精製系の確立を目指す。

Beforehand, the coliform bacteria are stabilized and the coliform bacteria are stabilized and the ABC transporter complex is confirmed. The origin of subtilis is のヒスチジンキナーゼBceS およびABC conveyor BceAB について, large スケールでの大発成によるrefining method をMosoした.そのRESULTS、GFP-Nanobodyレジンを用いた、ヒスチジンキナーゼBceSにThe method of adding GFP is the best way to judge the quality of the product.ここで, GFP タグはTEV プロテアーゼ cutting arrangement を Introduction してBceS のC terminal side にpay plus されており, TEV プロテアーThe target product, the BceS/BceAB complex, and the GFP-Nanobody were cut and dissolved using the いた.しかし, Current のプロトコルではタグ Cut off によるDissolution amount of the target productがSTRUCTURE ANALYSIS Arrangement of の検によるコンストラクトのoptimization and およびタグ cutting method Optimize the quality of the product using the するプロテアーゼmeasurement method and the による refining technique. Now the コンストラクトとしてはTEV プロテアーゼによる十なタグ Cut off がconfirmationされたため、From now on は citedき続きRefined hand Optimization of the method, analysis of the structure, stabilization of the BceS/BceAB complex, establishment of the purification system and the establishment of the system.

项目成果

Structural insight into the tRNA-dependent bifunctional mechanism of MprF

MprF tRNA 依赖性双功能机制的结构洞察

• 发表时间: 2022
• 作者: Michihiro Nishimura;Hisato Hirano;Cameron P. Gill;Christopher N. K. Phan;Yuka Yashiro;Keitaro Yamashita;Kazuhiro Kobayashi;Yoshiaki Kise;Tsukasa Kusakizako;Yuzuru Itoh;Kozo Tomita;Herve Roy;Tomohiro Nishizawa;Osamu Nureki
• 通讯作者: Osamu Nureki