新規抗生物質の標的分子探索を目指した病原菌の情報伝達経路プロテオームデータの創出

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近年，病原菌の環境適応，薬剤耐性などに関わる情報伝達経路(2成分伝達経路）を構成するヒスチジンキナーゼ(HK)の阻害剤の開発が国内外で進められている。その経路に含まれる一連のタンパク質，例えば，HK とペアをなすもう一つの成分であるレスポンスレギュレータ(RR)も新規抗生物質の標的となりうるが，HK とRRは化学的に不安定なヒスチジンやアスパラギン酸のリン酸化を介して情報伝達経路を行うため，質量分析による解析が適用できず，経路全体を俯瞰するプロテオームデータがない。本研究では「フォスタグ」を用いた不安定リン酸化タンパク質の解析技術を利用し，細菌のシグナル活性化と外部環境因子との関連を網羅的に解析する。そうして蓄積したデータから分子間相互作用や情報伝達機構のクロストークなどが明らかになり，阻害剤などの新規抗生物質の標的分子が浮かび上がるようになることを目的とする。昨年度は，腸管出血性大腸菌など強い病原性の株が知られる，大腸菌の２成分情報伝達経路 を再現した擬似的な大腸菌を作成することを目標とした。大腸菌には，遺伝子がタンデムに並び機能的なペアと考えられる HK とRRが 29 組あるので，それら計 58 遺伝子をクローニングした。検討のため，１ペアについて HKと RR を互いに異なる複製開始点を持つ２種類の発現プラスミドにそれぞれサブクローニングした。８種類の発現プラスミドを用いて，良好に発現する組み合わせを検討したところ，３組の組み合わせで，HK とRRの共発現が可能であった。今年度は，他のHK とRRについても同様に発現プラスミドにサブクローニングを行った。良好に発現する遺伝子と発現できない遺伝子があり，できるだけ多くの遺伝子が発現できるよう検討を続けている。また，病原性発現に関わるHKの発現に伴うトランスクリトーム変化を調べるRNAseqを計画している。