The Analysis of the mechanisms of the aging-mediated accumulation of CADASIL-mutated NOTCH3 protein

CADASIL突变NOTCH3蛋白衰老介导的积累机制分析

• 批准号: 22KJ0484
• 负责人: 鈴木 翔大
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0484/
• 关键词: CADASIL; 細胞老化; 脳微小環境; Notchシグナル; 糖鎖修飾; Fringe; ペリサイト

本年度は1. シングルセルRNA-seqデータベースを用いたマウス血管細胞におけるFringeおよびNotchリガンドの発現確認、2. 不死化ペリサイト細胞株HBPC/ci37の老化モデルの確立、3. CRISPRによるCADASIL型NOTCH3変異の導入を行った。1. 公的に公開されている、マウス血管細胞を用いたシングルセルRNA-seqデータベース(Vanlandewijck et al., Nature, 2018)からNOTCHリガンドであるDLL, JAGリガンドおよび、糖転移酵素Fringeファミリーの発現を血管細胞種ごとに比較した。血管内皮細胞ではDLL4やJAG1の発現が見られたが、ペリサイトや血管平滑筋細胞といった血管壁細胞ではDLL4の発現は見られずJAG1の発現が見られた。さらにRadical fringeがNOTCH3と同時に血管壁細胞で発現していることが明らかになった。以上からNOTCH3変異タンパクの蓄積に関わる細胞間相互作用が予測できた。2. HBPC/ci37を無血清培地で1日, 7日, 14日間培養後に老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)染色, 各種老化マーカーのqPCRを行った。その結果, 培養期間の延長に伴いSA-β-gal染色細胞の割合の増加やp21の発現上昇が見られた。よって, HBPC/ci37を無血清培地で14日間培養することで老化環境を模倣できた。3. HBPC/ci37の内在NOTCH3遺伝子にCADASIL型変異の1つであるC49Yの導入を行った。C49Yの点変異を挿入したcrRNAをtracrRNA、Cas9タンパク質とともにHBPC/ci37にエレクトポレーションをした。細胞からゲノムを回収して点変異を導入した領域をPCR増幅してシーケンス解析を行った。その結果、点変異の導入効率が約30%程度だった。

This year, 1. Fringe and Notch detection of vascular cells in the presence of the RNA-seq gene, 2. The establishment of an age-sensitive cell line HBPC/ci37, 3. CRISPR is a CADASIL type NOTCH3 variant. 1. The results of this study were published in Chinese and English (Vanlandewijck et al., 2001). Nature, 2018) NOTCH release from DLL, JAG release from DLL, glucose transfer enzyme Fringe release from DLL, JAG release from DLL, JAG release from DLL The expression of DLL4 and JAG 1 in vascular endothelial cells was detected in vascular smooth muscle cells and vascular wall cells. Radical fringe NOTCH3 is present in the blood vessel wall. The above NOTCH3 changes are related to the accumulation of cell-cell interactions. 2. HBPC/ci37 was cultured in serum-free medium on day 1, day 7, and day 14. After incubation, the aging related β-<$ritosph (SA-β-gal) staining was performed, and qPCR was performed for all kinds of aging. As a result, the prolonged culture period was accompanied by an increase in SA-β-gal staining and an increase in p21 expression. HBPC/ci37 was cultured in serum-free medium for 14 days. 3. HBPC/ci37 and NOTCH3 gene are introduced into CADASIL. C49Y is the first to introduce crRNA, Cas9, and HBPC/ci37. The cell phone number was changed from 0 to 1. The results show that the introduction rate of point difference is about 30%.

项目成果

遺伝性認知症CADASIL型NOTCH3変異タンパクの凝集と糖修飾の解析

遗传性痴呆CADASIL型NOTCH3突变蛋白的聚集和糖修饰分析

• 发表时间: 2023
• 作者: 鈴木翔大;塚本庸平;益子大樹;竹内英之;岡島徹也;伊藤素行
• 通讯作者: 伊藤素行

千葉大薬学研究院 生化学研究室・ホームページ

千叶大学药学院生物化学实验室/主页

The glycosylation mediated by Radical fringe is involved in ligand-independent aggregation and JAG1-dependent accumulation of NOTCH3 CADASIL mutant protein

Radical fringe 介导的糖基化参与 NOTCH3 CADASIL 突变蛋白的配体独立聚集和 JAG1 依赖性积累

• 发表时间: 2023
• 作者: Shodai Suzuki;Taiki Mashiko;Yohei Tsukamoto;Hideyuki Takeuchi;Tetsuya Okajima;Motoyuki Itoh
• 通讯作者: Motoyuki Itoh