転写因子TRF2とDNA高次構造体G4の構造解析およびシェルテリンの構造解析

转录因子TRF2和DNA高阶结构G4的结构分析以及shelterin的结构分析

• 批准号: 22KJ0562
• 负责人: 長村 怜奈
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0562/
• 关键词: テロメア; 構造解析; シェルテリン; クライオ電子顕微鏡

テロメアには6種類のタンパク質から構成されるシェルテリンとよばれる複合体が広範に結合する。これにより、二本鎖DNAの末端を含むテロメアが内在性のヌクレアーゼやDNA修復機構から誤認識され分解されるのを防いでいる。以上のような生理学的な重要性から、シェルテリンによる核酸認識機構の解明を目指した先行研究は多く行われてきたが、シェルテリンを構成するサブユニットのドメイン単位での構造解析しか行われていないため、限定的な知識しか得られていない。そのため、本研究ではシェルテリン複合体の核酸認識様式の解明のためクライオ電子顕微鏡を用いた単粒子構造解析を行うことにした。昨年TRF1、TRF2、TPP1、POT1、Rap1、TIN2の6種類全てを含むシェルテリン複合体の発現系および精製系の確立に成功した。昨年から課題となっていた、電子顕微鏡での撮影の際に用いるグリッドの調製段階でシェルテリン-核酸複合体が壊れてしまう問題に関して、複合体の架橋、核酸の条件検討、グリッドの条件検討、複合体精製方法など様々な条件を検討したが大きな改善は見られなかった。シェルテリン複合体単体での構造解析においては複合体とみられる密度マップの取得に成功したが、モデルを置くほどの分解能を得ることが難しかった。シェルテリン複合体の構成要素の既知構造のドメイン構造をあてはめると各構成要素のおおよその位置関係が明らかとなった。これをもとに今後詳細な構造を得るためのイニシャルモデルとする。

端粒被一种称为庇护所的复合物广泛绑定，该复合物由六种类型的蛋白质组成。这样可以防止包含双链DNA末端的端粒被内源性核酸酶和DNA修复机制误认为和降解。由于上述生理重要性，已经进行了许多先前的研究来阐明庇护素识别核酸识别的机制，但仅获得了有限的知识，因为对构成庇护所的亚基的结构分析是在域中进行的。因此，在这项研究中，我们决定使用低温电子显微镜分析单个颗粒的结构，以阐明庇护素复合物的核酸识别模式。去年，我们成功建立了庇护素综合体的表达系统和纯化系统，其中包括所有六种类型：TRF1，TRF2，TPP1，POT1，RAP1和TIN2。关于在电子显微镜下用于成像的电网制备阶段分解的庇护蛋白核酸复合物的问题，这是自去年以来一直是一个挑战，包括各种条件，包括对复合物的交联，检查了核酸的条件，检查了网格的条件，检查了网格的条件，以及用于净化复合物的方法，但没有观察到。在单独对庇护素复合物的结构分析中，我们成功地获取了一个似乎是复杂的密度图，但是很难获得足够的分辨率来放置模型。应用庇护蛋白络合物组成部分的已知结构的域结构揭示了每个组件之间的近似位置关系。基于此，我们将使用初始模型将来获得详细的结构。

项目成果

Structural and biochemical analysis to reveal how nucleosomes impede DNA cleavage by CRISPR-Cas9

结构和生化分析揭示核小体如何阻碍 CRISPR-Cas9 的 DNA 切割

• 发表时间: 2022
• 作者: Reina Nagamura;Tomoya Kujirai;Ryoya Nakagawa;Tsukasa Kusakizako;Hitoshi Kurumizaka;Osamu Nureki
• 通讯作者: Osamu Nureki