プロスタグランジンD合成酵素の立体構造決定と反応機構の解明

前列腺素D合酶三维结构的测定及反应机制的阐明

• 批准号: 08680650
• 负责人: 大久保 忠泰
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Japan Advanced Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08680650/
• 关键词: プロスタグランジンD合成酵素; NMR; ^<15>N-^1H HMQ^C; 多次元NMR; 2次構造

プロスタグランジンD_2合成酵素(PGDS)はプロスタグランジンH_2からプロスタグランジンD_2への異性化を触媒し、睡眠等の脳内活動の制御に関与する重要な酵素である。しかしながら、9,11-エピジオキシ基に特異的に作用するという興味深い性質を持つにも関わらず、その反応機構は解明されていない。PGDSはアミノ酸配列の相同性から疎水性低分子輸送に関与するリポカリンファミリーに属するが、このファミリー中で唯一酵素活性を有している。また、PGD合成酵素がレチノイン酸と強く結合することも示されている。そこで、本研究ではNMRを用いた溶液中の立体構造解析によりPGDSの反応機構を解明することを目的として、試料の大量発現系の構築及びNMRスペクトルの測定を行った。NMR測定に必要な20-40mgの試料を効率的かつ経済的に得るために、1-2Lの大腸菌培養でNMR測定に必要な量を確保出来るようにした。既にPGDSのcDNAはラットより純化DNAの形で単離され、大腸菌K2株の誘導体JM109をベクターとしてプラスミドpUC119に組み込まれているる培養条件、精製条件の検討を行いLB培地及びM9最小培地で目的蛋白質10mg/L-20mg/L以上の収量を達成した。そして、M9最小培地で大腸菌の栄養源に^<13>Cラベル化グルコース、^<15>Nラベル化塩化アンモニウムを用いて産出される蛋白質を100%NMR観測可能な安定同位体でラベルした。安定同位体ラベルした蛋白質のNMR試料を用いて2次元及び3次元NMRスペクトルの測定を行ない、PGDSのNMRシグナルの帰属を行った。多次元NMR法を用いることによりシグナルの分離が達成されシグナルの重なり合いの問題が解消された。得られたシグナル帰属をもとに主鎖間のNOE情報等によりPGDS中にローシート構造を見いだした。^<15>N-^1H HMQCスペクトルの結果から約3%の主鎖アミドプロトンのNMRシグナルに顕著な線幅増大が観測され、PGDS中にフレキシブルな領域が存在することが明らかとなった。このことはPGDSがレチノイン酸とPGH_2の両方と結合できることと関連していると考えられた。

The enzyme PGDS is an important enzyme involved in the regulation of the internal activities such as heterogenization, sleep, etc. 9, 11- PGDS has the unique enzyme activity in the process of acid alignment, low molecular weight transport, and high molecular weight. PGD synthase is a potent enzyme that binds to the enzyme. In this study, NMR was used to analyze the structure of PGDS in solution, construct a mass reaction system and determine the structure of PGDS. NMR determination requires 20-40mg of sample for efficiency and 1- 2 L of coliform culture for NMR determination. In addition, the purified DNA of PGDS cDNA was isolated from E. coli K2 strain JM109 and purified from pUC119 strain. The target protein concentration of 10mg/L-20mg/L or more was achieved in LB culture and M9 minimum culture. In addition, M9 minimal culture <13>of E. coli culture source, protein production, <15>and 100% NMR detection of possible stable isotopes. The NMR samples of stable isotopes were determined by 2D and 3D NMR, and the NMR samples of PGDS were determined by 2D and 3D NMR. The problem of separation and combination of the two groups was solved by using multiple element NMR. The main lock and the NOE information in the PGDS are shown in the table below. <15>N-1H HMQC test results show that about 3% of the main lock-out sites in the NMR spectrum increase in amplitude, PGDS in the presence of a clear field. PGH_2 and PGH_2 are the two main components of the equation.

项目成果

T.Aizawa, T.Ohkubo, et al: "Solution structure of an insect growth factor, growth-blocking peptide" J.Biol.Chem.274. 1887-1890 (1999)

T.Aizawa、T.Ohkubo 等人：“昆虫生长因子、生长阻断肽的溶液结构”J.Biol.Chem.274。

H.Sakashita: "Folding topology and DNA binding of the N-terminal fragment of Ada protein" FEBS Letter. 323. 252-256 (1993)

H.Sakashita：“Ada 蛋白 N 末端片段的折叠拓扑和 DNA 结合”FEBS Letter。

H.Sakashita: "Sequence-specific DNA recognition of the Escherichia coli Ada protein associated with the methylation-dependent functional switch for transcriptional regulation" J.Biochem.118. 1184-1191 (1995)

H.Sakashita：“大肠杆菌 Ada 蛋白的序列特异性 DNA 识别与转录调节的甲基化依赖性功能开关相关”J.Biochem.118。