ショウジョウバエPCNA遺伝子発現に必要な因子の同定と解析

(i)URE配列の中のDNA-蛋白質複合体形成に必要な領域をさらに詳細に決定し、この結果をもとにURE配列全体及び特定の領域をカバーする各種の配列に結合する因子のcDNAを、酵母one-hybrid systemを用いて探索した。5種類の配列、2種類のライブラリーを使って探索したが、最終的な候補は得られずに終わった。URE結合因子はone-hybrid systemでは検出できないタイプの因子であると考えられるため、ゲルシフト活性を指標にして培養細胞からこれを単離する計画である。今回の一連の実験により、URE結合因子とは異なった、PCNA遺伝子発現に重要な働きをしている新たな因子を同定した(投稿準備中)。(ii)アンチセンスDREF遺伝子配列の強制発現を行なった。熱ショックプロモーター、PCNA遺伝子プロモーター、唾腺染色体特異的なプロモーターからの発現では、弱い致死作用がみられる傾向があったが、正常発生する個体も多く、アンチセンス配列のコピー数を増やしても明確な効果が出ているとはいえなかった。そこでアンチセンス配列の発現時期と場所をさらに限定し、その影響を感度良く検出するために、眼の成虫原基特異的にアンチセンス配列発現を起こしてみたところ、個体差なく成虫での個眼の並びに異常が認められた。したがって、正常な眼の分化発達においてDREF遺伝子が必要とされることがわかった。(iii)DREF遺伝子が存在する第2染色体30F領域に、Pエレメントの一種であるP{lacW}が挿入したハエを複数系統入手した。これらの系統をもとに、P{lacW}を再び転移させて眼の色の濃さからその転移を確認する実験系をつくった。DREF遺伝子のP{lacW}挿入変異体や、欠失変異体を得ることを目的として、DREF遺伝子やその近傍に新たに挿入したPエレメントを得るためのPCRを用いた探索を行なっている。

(i)URE配列の中のDNA-蛋白質複合体形成に必要な領域をさらに詳細に決定し、この結果をもとにURE配列全体及び特定の領域をカバーする各種の配列に結合する因子のcDNAを、酵母one-hybrid systemを用いて探索した。5種類の配列、2種類のライブラリーを使って探索したが、最終的な候補は得られずに終わった。URE結合因子はone-hybrid systemでは検出できないタイプの因子であると考えられるため、ゲルシフト活性を指標にして培養細胞からこれを単離する計画である。今回の一連の実験により、URE結合因子とは異なった、PCNA遺伝子発現に重要な働きをしている新たな因子を同定した(投稿準備中)。(ii)アンチセンスDREF遺伝子配列の強制発現を行なった。熱ショックプロモーター、PCNA遺伝子プロモーター、唾腺染色体特異的なプロモーターからの発現では、弱い致死作用がみられる傾向があったが、正常発生する個体も多く、アンチセンス配列のコピー数を増やしても明確な効果が出ているとはいえなかった。そこでアンチセンス配列の発現時期と場所をさらに限定し、その影響を感度良く検出するために、眼の成虫原基特異的にアンチセンス配列発現を起こしてみたところ、個体差なく成虫での個眼の並びに異常が認められた。したがって、正常な眼の分化発達においてDREF遺伝子が必要とされることがわかった。(iii)DREF遺伝子が存在する第2染色体30F領域に、Pエレメントの一種であるP{lacW}が挿入したハエを複数系統入手した。これらの系統をもとに、P{lacW}を再び転移させて眼の色の濃さからその転移を確認する実験系をつくった。DREF遺伝子のP{lacW}挿入変異体や、欠失変異体を得ることを目的として、DREF遺伝子やその近傍に新たに挿入したPエレメントを得るためのPCRを用いた探索を行なっている。