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Elucidation of high gravity-sensing mechanisms in cells and its application to control cellular phenotype and differentiation

阐明细胞中的高重力感应机制及其在控制细胞表型和分化中的应用

基本信息

批准号：
22K19898
负责人：
坂元尚哉
金额：
$ 3.99万
依托单位：
Tokyo Metropolitan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度はまず二次元平面基質に培養した細胞への高重力負荷を行った．カバーガラス上に培養した平滑筋細胞に対してプレート遠心分離機を用い，通常培養状態での重力方向である細胞下向きに1000gの高重力を１０分間にわたって負荷した．その後，細胞骨格であるアクチンフィラメントおよび微小管，また細胞核を蛍光染色により可視化し，それぞれ顕微鏡観察を行った．その結果，通常重力環境（１g）で培養した細胞と比較し，細胞骨格構造および細胞核形状ともに高重力負荷の顕著な影響は認められなかった．このことから，細胞鉛直下方向への高重力負荷は細胞構造に変化を与えないことが示唆された．さらに，細胞の側方向からの重力負荷も試みた．遠沈管内にシリコーンゴム製の台座を設置し，カバーガラスを立てた状態で遠心分離を行った．その結果，台座およびカバーガラスともに高重力の影響と考えられる破損が生じ，細胞観察まで至らなかった．また，高重力環境による細胞形質変化の評価に用いるPCR法の確立を行った．特に，コラーゲンゲル基質中に包埋した平滑筋細胞からのRNA抽出方法に関して，サンプル保存および破砕方法，使用する溶媒，またスピンカラムの組み合わせを検討した．抽出の際にRNAが破壊されるケースも存在したものの，結果的に安定的なRNA抽出方法を確立することができた．その後，平滑筋細胞の表現型制御培養液を用いて，遠心圧縮したコラーゲンゲル中の平滑筋細胞を合成型から収縮型に誘導した後，RNAを抽出した．PCR法により収縮型平滑筋細胞マーカーである平滑筋ミオシン重鎖や平滑筋αアクチンの発現量増加を確認できた．

This year's two-dimensional planar matrix culture of cells under high gravity load. The cells were cultured in the upper part of the culture medium, and the cells were cultured in the upper part of the culture medium, and the cells were cultured in the lower part of the culture medium. The cells were stained with light and visualized under microscope. As a result, the cells were cultured in a normal gravity environment (1g), and the cellular structure and nuclear shape of the cells were affected by high gravity load. The vertical direction of the cell and the high gravity load on the cell structure change. In the evening, the cell's lateral direction falls and the gravity load falls. Set up the pedestal of the remote control system in the remote sink tube, set up the remote control system in the remote control system, and set up the remote control system. As a result, the effects of high gravity and damage caused by the test occurred on the pedestal and the camera, and the observation of cells became even more serious. The PCR method was used to establish the evaluation of cell morphology in high gravity environment. In particular, RNA extraction methods for embedding smooth muscle cells in a matrix, preservation methods, and assembly methods using solvents are discussed. The RNA extraction method was established. After that, the smooth muscle cell phenotype control culture medium was used, and the RNA was extracted after the smooth muscle cell synthesis was induced by telecentric compression.PCR method confirmed the increase of smooth muscle cell phenotype.