新規リポソーム再構成法による膜電位、膜張力依存的イオンチャネルの作動機構の解明

本研究は、申請者独自の新規リポソーム再構成法とクライオ電子顕微鏡を組み合わせることによって、電位依存性や膜張力依存性イオンチャネルの静止膜電位下、膜張力のかかった状態での構造を解明し、膜電位、膜張力変化によるチャネルの開閉機構の理解を目的とする。本年度は、まずはじめに、バクテリア由来の電位依存性イオンチャネル（BacVGC）を用いてリポソーム再構成法の最適化条件検討を行った。BacVGCを界面活性剤で可溶化し、精製後に、我々独自の手法によってリポソーム上にBacVGCを再構成した。グリッド上に再構成サンプルを添加し、瞬間凍結し、クライオ電子顕微鏡で観察した。その結果リポソームが再構成されていることが確認できた。マイクログラフを撮影し、２D画像クラス分け解析を行い、BacVGCと推定されるタンパク質がリポソーム上に存在することが分かった。さらに、膜張力依存的イオンチャネルをリポソームへ再構成するために、発現と精製系の構築を行った。界面活性剤可溶化条件において、2.7Åの分解能で構造決定に成功した。興味深いことに、脂質膜と相互作用すると考えられる領域の密度が見えておらず、リポソームに再構成することによって可視化され、膜張力との関係も議論できると期待される。さらに、浸透圧刺激依存的イオンチャネルの構造も界面活性剤条件下で構造決定に成功した。新規フォールドであることも明らかになり、リポソーム脂質二重膜に再構成することによって浸透圧との関係性が明らかにできると期待される。

本研究は、申請者独自の新規リポソーム再構成法とクライオ電子顕微鏡を組み合わせることによって、電位依存性や膜張力依存性イオンチャネルの静止膜電位下、膜張力のかかった状態での構造を解明し、膜電位、膜張力変化によるチャネルの開閉機構の理解を目的とする。本年度は、まずはじめに、バクテリア由来の電位依存性イオンチャネル（BacVGC）を用いてリポソーム再構成法の最適化条件検討を行った。BacVGCを界面活性剤で可溶化し、精製後に、我々独自の手法によってリポソーム上にBacVGCを再構成した。グリッド上に再構成サンプルを添加し、瞬間凍結し、クライオ電子顕微鏡で観察した。その結果リポソームが再構成されていることが確認できた。マイクログラフを撮影し、２D画像クラス分け解析を行い、BacVGCと推定されるタンパク質がリポソーム上に存在することが分かった。さらに、膜張力依存的イオンチャネルをリポソームへ再構成するために、発現と精製系の構築を行った。界面活性剤可溶化条件において、2.7Åの分解能で構造決定に成功した。興味深いことに、脂質膜と相互作用すると考えられる領域の密度が見えておらず、リポソームに再構成することによって可視化され、膜張力との関係も議論できると期待される。さらに、浸透圧刺激依存的イオンチャネルの構造も界面活性剤条件下で構造決定に成功した。新規フォールドであることも明らかになり、リポソーム脂質二重膜に再構成することによって浸透圧との関係性が明らかにできると期待される。