新規リポソーム再構成法による膜電位、膜張力依存的イオンチャネルの作動機構の解明

使用新型脂质体重构方法阐明膜电位和膜张力依赖性离子通道的运行机制

基本信息

批准号：
22K19263
负责人：
木瀬孔明
金额：
$ 4.16万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19263/
关键词：
イオンチャネルリポソーム

项目摘要

本研究は、申請者独自の新規リポソーム再構成法とクライオ電子顕微鏡を組み合わせることによって、電位依存性や膜張力依存性イオンチャネルの静止膜電位下、膜張力のかかった状態での構造を解明し、膜電位、膜張力変化によるチャネルの開閉機構の理解を目的とする。本年度は、まずはじめに、バクテリア由来の電位依存性イオンチャネル（BacVGC）を用いてリポソーム再構成法の最適化条件検討を行った。BacVGCを界面活性剤で可溶化し、精製後に、我々独自の手法によってリポソーム上にBacVGCを再構成した。グリッド上に再構成サンプルを添加し、瞬間凍結し、クライオ電子顕微鏡で観察した。その結果リポソームが再構成されていることが確認できた。マイクログラフを撮影し、２D画像クラス分け解析を行い、BacVGCと推定されるタンパク質がリポソーム上に存在することが分かった。さらに、膜張力依存的イオンチャネルをリポソームへ再構成するために、発現と精製系の構築を行った。界面活性剤可溶化条件において、2.7Åの分解能で構造決定に成功した。興味深いことに、脂質膜と相互作用すると考えられる領域の密度が見えておらず、リポソームに再構成することによって可視化され、膜張力との関係も議論できると期待される。さらに、浸透圧刺激依存的イオンチャネルの構造も界面活性剤条件下で構造決定に成功した。新規フォールドであることも明らかになり、リポソーム脂質二重膜に再構成することによって浸透圧との関係性が明らかにできると期待される。

这项研究旨在通过将申请人独特的新型脂质体重建方法与冷冻电子显微镜结合在一起，了解静止膜电位和膜张力下的电压依赖性和膜张力依赖性离子通道的结构，并了解偏离和闭合因束构成余音和膜含量而变化的机制。今年，我们首先使用细菌衍生的电压依赖性离子通道（BACVGC）研究了脂质体重建的优化条件。用表面活性剂溶解BACVGC，纯化后，使用我们自己的方法在脂质体上重构BACVGC。将重构的样品添加到网格中，闪存冷冻，并在冷冻电子显微镜下观察。结果，已经确认脂质体已被重构。拍摄显微照片并进行了2D图像分类分析，以发现在脂质体上推断出作为BACVGC的蛋白质。此外，构建表达和纯化系统以将膜张力依赖性离子通道重新构建为脂质体。在表面活性剂溶解条件下，以2.7Å的分辨率成功确定了该结构。有趣的是，被认为与脂质膜相互作用的区域的密度不可见，预计将通过重建脂质体将其可视化，并且还可以讨论与膜张力的关系。此外，在表面活性剂条件下，还成功确定了渗透刺激依赖性离子通道的结构。还揭示了这是一个新的折叠，可以通过将其重建为脂质体脂质双层来揭示与渗透压的关系。