Does phase-separation of DNA double-strand break repair factors promote chromosome rearrangement?

本研究の目的は、53BP1やその他のDNA二本鎖切断（DSB）修復因子の相分離と染色体再編成の関係を明らかにすることである。2022年度は、オンラインプログラムで天然変性領域を持つことが予測されたDSB修復関連因子が、細胞内のDSB部位で相分離するかどうかを調べた。DSB修復関連因子のDSB部位における集積は、正常ヒト網膜上皮細胞RPE-hTERT細胞にγ線を照射後固定して、それぞれのDSB修復関連因子に対する抗体を用いた蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡下で斑点状の「フォーカス」として可視化した。相分離阻害剤としては、1,6-ヘキサンジオールや酢酸アンモニウム、スクロースを用い、γ線照射30分前から固定時まで細胞に処理した。この実験の結果、DSB修復関連因子のうち、CtIP、BRCA1、RAD51AP1タンパク質が相分離阻害剤処理時にDSB部位にフォーカスを形成しなくなることがわかった。この結果はこれらのタンパク質のDSB部位への集積に相分離が必要であることを示唆する。さらにCtIPについては、GFP融合タンパク質を発現するベクターを作製して細胞に導入したところ、GFP-CtIPは相分離するタンパク質の特徴である、液滴形成を示した。この結果はCtIPタンパク質が相分離していることを示している。また53BP1に関しては、相分離に必要な領域を欠失した「相分離不能変異体」の発現ベクターを作製中である。

本研究の目的は、53BP1やその他のDNA二本鎖切断（DSB）修復因子の相分離と染色体再編成の関係を明らかにすることである。2022年度は、オンラインプログラムで天然変性領域を持つことが予測されたDSB修復関連因子が、細胞内のDSB部位で相分離するかどうかを調べた。DSB修復関連因子のDSB部位における集積は、正常ヒト網膜上皮細胞RPE-hTERT細胞にγ線を照射後固定して、それぞれのDSB修復関連因子に対する抗体を用いた蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡下で斑点状の「フォーカス」として可視化した。相分離阻害剤としては、1,6-ヘキサンジオールや酢酸アンモニウム、スクロースを用い、γ線照射30分前から固定時まで細胞に処理した。この実験の結果、DSB修復関連因子のうち、CtIP、BRCA1、RAD51AP1タンパク質が相分離阻害剤処理時にDSB部位にフォーカスを形成しなくなることがわかった。この結果はこれらのタンパク質のDSB部位への集積に相分離が必要であることを示唆する。さらにCtIPについては、GFP融合タンパク質を発現するベクターを作製して細胞に導入したところ、GFP-CtIPは相分離するタンパク質の特徴である、液滴形成を示した。この結果はCtIPタンパク質が相分離していることを示している。また53BP1に関しては、相分離に必要な領域を欠失した「相分離不能変異体」の発現ベクターを作製中である。