COEベクターを用いたX線照射ヒト初代培養細胞におけるP53蓄積機構の解明

使用 COE 载体阐明 X 射线照射的人原代培养细胞中 P53 积累机制

• 批准号: 03J50821
• 负责人: 山内 基弘
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J50821/
• 关键词: COEベクター; p53; リン酸化; 蓄積; アラニン置換; ヒト初代培養細胞

昨年度はCOEベクターがゲノムに組み込まれる際に生じるDNA二重鎖切断にヒト初代培養細胞が反応したことによるものと思われる、早期細胞老化が誘導されたため、本年度はクローン単離はせず、ベクター導入後すぐに選択培地中で培養することで実験に用いるまでの分裂回数を減らす工夫をした。それにもかかわらず、X線照射後のリン酸化部位アラニン置換型p53蛋白質のレベルを見るウエスタンブロットを行うのに十分な細胞数まで増殖する細胞は得られなかった。上記の実験と並行して、ヒト初代培養細胞がベクター導入時に生じると思われる、ごく少数のDNA二重鎖切断でなぜ増殖が抑制されるのかを調べた。この際、DNA二重鎖切断に伴うクロマチン構造変化を認識し、その部位にフォーカスを形成するSer1981リン酸化ATM蛋白質に着目した。本研究で用いているヒト初代培養細胞に低線量のX線照射後、リン酸化ATM蛋白質のフォーカスを経時的に観察した結果、最初に形成されたフォーカスの数は、DNA二重鎖切断修復に伴い経時的に減少したが、長時間残存するフォーカスは明らかに大きくなっていることが分かった。このフォーカスのサイズ増大と増殖抑制のシグナル増幅の関係を明らかとするため、リン酸化ATMフォーカスの直径とSer15リン酸化p53蛋白質の蓄積の関係を調べた結果、フォーカスサイズに比例してリン酸化p53陽性細胞の割合が増加することが分かった。さらに大きなリン酸化ATMフォーカスを持つG1期細胞は永久的にS期に進行できないことも明らかとなった。この結果から、ベクターが導入されたゲノム領域はDNA二重鎖切断再結合後もクロマチンの高次構造が回復しておらず、その部位に大きなリン酸化ATMフォーカスが形成されることによって、その細胞の増殖が抑制されることが示唆された(論文準備中)。

Last year, COE was introduced into the culture medium, DNA double lock was cut, the number of cells in primary culture was reduced, and the number of cells in primary culture was reduced. After X-ray irradiation, the p53 protein was replaced by p53 protein, and the number of cells increased. In addition, in the initial culture of cells, the DNA double lock was cut and the growth was inhibited. At this time, DNA double lock cleavage is accompanied by structural transformation, and the formation of Ser1981 protein is observed. In this study, we observed the results of initial culture of primary cells after low-dose X-ray irradiation, the number of initial DNA formation, the decrease of DNA double-lock repair associated with DNA repair, and the long-term survival of primary cells after X-ray irradiation. The relationship between the increase in cell size and proliferation inhibition and the increase in cell size, cell diameter and Ser15 protein accumulation in p53 positive cells was investigated. The cells in G1 phase are in permanent phase. The results showed that the DNA double lock was cut and recombined, and the higher order structure of DNA was restored and the DNA double lock was inhibited (paper preparation).

项目成果

放射線照射後残存するDNA損傷チェックポイント因子のフォーカスの生物学的意義

关注放射线照射后残留的DNA损伤检查点因子的生物学意义

• 发表时间: 2005
• 期刊: 放射線生物研究 40(3)
• 作者: 山内基弘;山内基弘;山内基弘
• 通讯作者: 山内基弘

The role or phosphorylation in IR-induced p53 stabilization and activation

磷酸化在 IR 诱导的 p53 稳定和激活中的作用

• 发表时间: 2005
• 期刊: Acta Medica Nagasakiensia 50
• 作者: 山内基弘

Stabilization of alanine substituted p53 at Ser15, Thr18, and Ser20 in response to ionizing radiation

丙氨酸取代 p53 Ser15、Thr18 和 Ser20 响应电离辐射的稳定性

• 发表时间: 2004
• 期刊: Biochemical and Biophysical Research Communications 323
• 作者: 山内基弘;鈴木啓司;児玉靖司;渡邉正己
• 通讯作者: 渡邉正己