細胞間接着構造の極性形成を開始させる新規タンパク質相互作用の構造生物学的研究

启动细胞间粘附结构极性形成的新型蛋白质相互作用的结构生物学研究

基本信息

  • 批准号:
    13J10057
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.98万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for JSPS Fellows
  • 财政年份:
    2013
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2013-04-01 至 2016-03-31
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

前年度までに、α-catenin/merlin複合体の研究において、それらの相互作用領域を特定した。また、相互作用が確認できたタンパク質領域において結晶化スクリーニングを行い、いくつかの複合体結晶を得ることができたが、分解能の改善に難航していた。本年度は相互作用が確認できた領域のうち、これまで結晶化を試みていなかった領域について結晶化初期スクリーニングを行い、いくつかの結晶を得ることができた。結晶化に用いた溶液で得られた結晶を洗浄し、SDS-PAGEによって複合体であるかを確認した結果、αE-catenin/merlin複合体の結晶である可能性が示唆された。そのため、放射光施設でのX線回折実験を行い、分解能2.5 angstromの回折データを取得した。分子置換法による位相決定、初期モデルの構築を行い、Rwork/Rfree=20.0/24.1まで構造精密化を行った。その結果、結晶の非対称単位中に、2分子のmerlin FERM (19-314)ドメインが存在していた。2分子のmerlin FERM (19-314)ドメインに対して、2分子のαE-catenin由来の電子密度が確認できた。決定した結晶構造から、merlin FERM (19-314)ドメインのサブドメインCに位置するα1Cとβ5Cの間に形成される疎水性の溝に、αE-cateninがβシートを形成して相互作用していた。結晶構造からα-cateninとの相互作用に重要なmerlinのアミノ酸残基として、疎水性アミノ酸残基Leu297とIle301が示唆された。それらをグルタミン酸に置換したmerlin FERM (19-314) I301E変異体、L297E I301E変異体を調製して、αN-catenin D1ドメイン (1-261) との相互作用解析を行った。その結果、merlin FERM (19-314) WTと比較して、各merlin FERM (19-314) 変異体とαN-catenin (1-261) との相互作用が著しく阻害された。このことから、merlinのLeu297とIle301は、α-cateninとの相互作用に重要な残基として機能していることが示された。
In the past year, the study of α-catenin/merlin complex has been carried out in a specific field. In addition, the interaction and crystallization of complex crystals are confirmed. In addition, the decomposition energy is improved. This year, the interaction between the two regions was confirmed, and the crystallization was tried. Crystallization solution was used to obtain crystallization, SDS-PAGE was used to confirm the crystallization results, and the possibility of crystallization of αE-catenin/merlin complex was shown. The X-ray reflection of the radiation device is in the middle of the operation, and the resolution energy of 2.5 angstrom is obtained. Molecular replacement method for phase determination, initial phase construction, Rwork/Rfree=20.0/24.1, structural refinement As a result, 2 molecules of merlin FERM (19-314) equipment were found in the asymmetric unit of crystal. The electron density of 2-merlin FERM (19-314) was confirmed. Determination of crystal structure, merlin FERM (19-314), the formation of water channel, the formation of α1C and β5C, the formation of αE-catenin and β 1C interaction. Crystal structure: α-catenin interaction is important for merlin acid residues Leu297 and Ile301. The interaction analysis of αN-catenin D1 (1-261) was carried out. As a result, merlin FERM (19-314) WT and αN-catenin (1-261) interactions between merlin FERM (19-314) WT and αN-catenin (1-261) WT were found to be harmful. The interaction of α-catenin with Leu297 and Ile301 is important for the function of the residue.

项目成果

期刊论文数量(0)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
α-catenin VH1ドメインの遊離型単量体の結晶構造解析
α-连环蛋白VH1结构域游离单体的晶体结构分析
  • DOI:
  • 发表时间:
    2015
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    Shibahara;T.
  • 通讯作者:
    T.
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