天然物生合成遺伝子の発現による大腸ガン原因物質の生合成および化学構造の決定

通过天然产物生物合成基因的表达进行结直肠癌致癌物质的生物合成和化学结构测定

基本信息

批准号：
13J10688
负责人：
石川格靖
金额：
$ 1.41万
依托单位：
University of Shizuoka
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

【背景・目的】コリバクチンは大腸菌IHE3034株が哺乳類細胞に感染した後、哺乳類細胞からの何らかのシグナル物質により誘導される化合物であると予測されている。従って、本化合物の単離は困難であり、未だ部分構造ですら明らかにされていない。一方、大腸がん発症患者の66.7 %から本菌が検出されている。そこで、本化合物の正体を有機化学的に明らかにし、大腸がん形成メカニズムの解明および予防のためのバイオマーカーとすることを目的として研究に着手した。【方法・結果】我々はコリバクチン生合成に必要とされるclbA~clbQの各遺伝子を発現し、in vitro反応による生合成経路の再構築を試みた。これまで、ペプチド合成酵素 (nonribosomal peptide synthase, NRPS) であるClbNより生合成が開始され、次にNRPSとポリケタイド合成酵素 (PKS) 複合体であるClbBへ受け渡されることが報告されていた。そこでClbN、ClbBの発現ベクターを作製し、これを用い大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体の代謝産物をLC－MSに供した結果、ミリスチン酸、D-AsnおよびL-Ala縮合体の生成が観測された。本化合物はClbNとClbBのNRPSにより生合成されるものと予測され、ClbB のPKSによる代謝産物を確認することはできなかった。これはClbBのC末端にチオエステラーゼは存在せず、生合成中間体が切り出されなかったためと考えられた。そこで化学合成した推定生合成中間体を標品とし、ClbNとClbBの生合成産物を解析した。その結果、ClbNはN-myristoyl-D-asparagine (1) を生産していることが明らかとなった。次に、本化合物をClbBと反応させたところ、ClbB代謝産物は1とL-Alaおよびマロン酸縮合体 (2) であることが特定された。続いて、2を基質に遺伝子クラスター内の各PKSと反応させたところ、新規代謝産物中間体を見いだすことに成功した。

背景和目的：预计结肠痛是在大肠杆菌菌株IHE3034之后由哺乳动物细胞的某些信号物质诱导的化合物会感染哺乳动物细胞。因此，这种化合物的隔离是困难的，甚至局部结构尚未得到揭示。另一方面，在66.7％的结肠癌患者中发现了这种细菌。因此，我们开始研究，目的是阐明该化合物的真实性质，并将其用作阐明结肠癌形成和预防机理的生物标志物。 [方法和结果]我们将CLBA表达为Colibactin生物合成所需的CLBQ基因，并试图通过体外反应重建生物合成途径。到目前为止，据报道，非核糖体肽合酶（NRPS）的CLBN始于生物合成，然后传递到NRPS和Polyketide合酶（PKS）复合物CLBB。因此，制备了CLBN和CLBB的表达向量，并使用该载体转化大肠杆菌。将所得转化剂的代谢产物经过LC-MS，并观察到肉豆蔻酸，D-ASN和L-ALA冷凝物的形成。该化合物预计将通过CLBN和CLBB的NRP生物合成，并且无法确认由PKS引起的CLBB代谢产物。这被认为是因为CLBB的C-末端没有硫酯酶，因此未切除生物合成中间体。因此，将推定的生物合成中间体化学合成用作标本，并分析了CLBN和CLBB的生物合成产物。结果，据揭示了CLBN产生N- myristoyl-d-sparagine（1）。然后将化合物与CLBB反应，并将CLBB代谢产物鉴定为1和L-Ala和Malonic Acid凝结物（2）。随后，当2与基因簇中的每个PK作为底物反应时，它成功地找到了一种新型的代谢产物中间体。