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天然物生合成遺伝子の発現による大腸ガン原因物質の生合成および化学構造の決定

通过天然产物生物合成基因的表达进行结直肠癌致癌物质的生物合成和化学结构测定

基本信息

批准号：
13J10688
负责人：
石川格靖
金额：
$ 1.41万
依托单位：
University of Shizuoka
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

【背景・目的】コリバクチンは大腸菌IHE3034株が哺乳類細胞に感染した後、哺乳類細胞からの何らかのシグナル物質により誘導される化合物であると予測されている。従って、本化合物の単離は困難であり、未だ部分構造ですら明らかにされていない。一方、大腸がん発症患者の66.7 %から本菌が検出されている。そこで、本化合物の正体を有機化学的に明らかにし、大腸がん形成メカニズムの解明および予防のためのバイオマーカーとすることを目的として研究に着手した。【方法・結果】我々はコリバクチン生合成に必要とされるclbA~clbQの各遺伝子を発現し、in vitro反応による生合成経路の再構築を試みた。これまで、ペプチド合成酵素 (nonribosomal peptide synthase, NRPS) であるClbNより生合成が開始され、次にNRPSとポリケタイド合成酵素 (PKS) 複合体であるClbBへ受け渡されることが報告されていた。そこでClbN、ClbBの発現ベクターを作製し、これを用い大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体の代謝産物をLC－MSに供した結果、ミリスチン酸、D-AsnおよびL-Ala縮合体の生成が観測された。本化合物はClbNとClbBのNRPSにより生合成されるものと予測され、ClbB のPKSによる代謝産物を確認することはできなかった。これはClbBのC末端にチオエステラーゼは存在せず、生合成中間体が切り出されなかったためと考えられた。そこで化学合成した推定生合成中間体を標品とし、ClbNとClbBの生合成産物を解析した。その結果、ClbNはN-myristoyl-D-asparagine (1) を生産していることが明らかとなった。次に、本化合物をClbBと反応させたところ、ClbB代謝産物は1とL-Alaおよびマロン酸縮合体 (2) であることが特定された。続いて、2を基質に遺伝子クラスター内の各PKSと反応させたところ、新規代謝産物中間体を見いだすことに成功した。

Background Objective: To detect the compounds induced by E. coli strain IHE3034 in mammalian cells after infection. The structure of this compound is difficult to separate. 66.7% of the patients with side and colon diseases were infected with the bacteria. The organic chemistry of this compound is studied in detail. [Methods and Results] We tried to reconstruct the biosynthetic pathway in vitro by developing the necessary genes of clbA~clbQ. ClbN biosynthesis is initiated by NRPS, a nonribosomal peptide synthase (NRPS), and reported by PKS complex. ClbN and ClbB are the most common forms of E. coli. LC-MS was used to determine the metabolites of the morphologic variant, and the formation of the D-Asn, D-Ala and D-Asn condensates. The compound is synthesized from ClbN and ClbB in NRPS and identified as a metabolite of ClbB in PKS. The C-terminal of ClbB was isolated and synthesized. Chemical synthesis and analysis of synthetic products of ClbN and ClbB ClbN N-myristoyl-D-aspartate (1) ClbB metabolites 1-Ala-2 - 3-Ala-3-Ala-4 - 3 - 4-Ala-3 - 4-Ala-4 2. The PKS in the matrix and the metabolites in the matrix were successfully synthesized.