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無細胞翻訳系を用いたＳｅｃＹＥＧトランスロコンの機能発現メカニズムの解析

利用无细胞翻译系统分析SecYEG易位子的功能表达机制

基本信息

批准号：
13J06852
负责人：
松林英明
金额：
$ 1.92万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度までに、無細胞翻訳系によるSecYEGの再構築と、それに基づいて合成する膜タンパク質のliposome膜上でのトポロジー制御について成果をまとめ、論文発表と複数の学会での発表をすることができた。本年度は、さらに研究を発展させるべく、SecYEGの無細胞合成に必要な脂質組成の解析と、合成したSecYEGの１分子観察を行った。脂質組成の解析について、昨年度までは脂質抽出物を用いた場合でしかSecYEGの活性がみられていなかったが、脂質の脂肪酸の条件検討により合成脂質で再構成することに成功した。脂質抽出物はGiant Unilamellar Vesicle (GUV)の作成などに適さなかったため、今回得られた結果により、人工細胞システムや膜タンパク質の試験管内進化への幅広い応用が期待できる。また、昨年度に見出された糖脂質様の分子について、微量な分子なために解析が難しかったが、岩手大学西山研究室との共同研究先で引き続き解析を行って頂いている。SecYEGの膜透過活性について、基質の分泌タンパク質であるpOmpAのアミノ酸長を短くした場合に、再構成系においても膜透過のターンオーバーが検出された。詳細な速度論の解析を行うため東京大学野地研究室との共同研究で１分子観察に取り組んだ。まず、無細胞系によるSecY、SecEの蛍光標識と人工脂質平面膜上への再構成の条件を確立し、全反射顕微鏡によって観察したところ、SecYやSecEのサブユニットが単独で存在する場合も、純粋な脂質膜上では安定的に拡散することが初めて明らかになった。また、膜透過反応を観察するためpOmpAを蛍光標識して１分子観察を行ったが、脂質膜への非特異的な結合が見られた。条件検討を行ったものの、顕微鏡上に再構成する平面膜の不安定性もあり膜透過反応を解析するには至らなかったが、精製と再構成の煩雑さから１分子観察系の例が少ない膜タンパク質について、無細胞翻訳系の有用性を示す結果を得た。

Last year, the whole system, the SecYEG, the synthesis, the synthesis. This year, we will conduct research on SecYEG cell-free synthesis, analysis of the necessary lipid components, and synthesis of SecYEG molecules. The composition of the fat was analyzed, and the extract of the fat was successfully synthesized by the combination of SecYEG and fatty acid, the condition of the fatty acid, the synthesis of the fat, the synthesis of the fat, the composition of the fat, the extraction of the fat, the activity of the fat, the fatty acid and the fatty acid. The lipid extract Giant Unilamellar Vesicle (GUV) was made into a compound, the results of which were obtained this time, and the artificial cell was used to measure the amplitude of the membrane in the tube. Last year, it was published that glycolipid molecules, trace molecules, and the Nishiyama Research Laboratory of Iwate University were jointly studied. The SecYEG membrane was synthesized by the active enzyme, the substrate secreted by the substrate, the pOmpA membrane by the substrate, and the complex by the growth of the membrane. In the field laboratory of Beijing University, the field laboratory of Beijing University is involved in the joint study of molecular monitoring and tissue analysis. Cell-free, cell-free, SecY, and SecE light labeling, the surface of the artificial fat membrane is reorganized into conditional confirmation, total reflection, and total reflection. The film is used to detect the specific properties of the lipid membrane by means of the combination of molecular and lipid membranes, which can be detected by the reverse scanning electron microscope (pOmpA). The conditions are as follows: in the micrograph, the surface film is made into a flat film, and the qualitative analysis is carried out through the reverse chromatography. The analysis is performed to determine the molecular weight of the system, and the results show that the results show the usefulness of the system.