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部位特異的変異導入によるＭＭＬＶ逆転写酵素の耐熱性と逆転写の正確性の向上

通过定点突变提高MMLV逆转录酶的热稳定性和逆转录的准确性

基本信息

批准号：
13J01955
负责人：
小西篤
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

耐熱型モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（MMLV RT）の耐熱化機構を明らかにするため、野生型MMLV RT（WT）および耐熱型MMLV RTであるE286R、E302K、L435R、D524A、MM4のUV、蛍光、およびCDスペクトルを比較した。耐熱型のスペクトルはWTと同様の形状であり、いずれの耐熱化変異もRTのTrp残基、Tyr残基近傍の環境および分子全体の二次構造に大きな影響を与えないことがわかった。続いて、基質である鋳型プライマー（T/P）と各RTの親和力を評価した。T/P-RT複合体の解離定数は同程度であり、耐熱化変異はRTのT/Pに対する親和力に影響を与えないことがわかった。さらに、RNase H活性を評価した。WTでは反応開始15秒後にRNAが分解されたが、耐熱型では反応開始40分後においても分解されなかった。RNase H活性の活性部位に変異を導入したD524AとMM4とは異なり、E286R、E302K、L435RはRNase H活性部位から離れた部位に変異が導入されているにもかかわらず、RNase H活性を消失した。E286R、E302K、L435Rの耐熱化は、D524AやMM4 と同様にRNase H活性の消失に起因すると考えられた。核酸系阻害剤（NRTI）耐性変異に相当する変異、Q84D、V223I、N249Wを導入することで、逆転写の正確性の向上を試みた。四種のdNTPのうち三種のdNTP存在下でプライマー伸長反応を行ったところ、Q84D、V223I、N249Wによる生成物は野生型酵素による生成物より短かった。NRTI耐性変異に相当する変異、Q84D、V223I、N249WによりMMLV RTの逆転写の正確性が向上することが示唆された。逆転写の正確性をより正確に評価する実験系を学ぶため、Dr. Menendez-Arias（Centro de Biologia Molecular “Severo Ochoa”, Madrid, Spain）のもとで指導を受けた（1月12日-2月12日）。帰国後、ブルーホワイトセレクション法を用いたRTの性能測定法のための実験環境を整え、実験系を立ち上げた。現在、本研究は他の研究者により継続されている。

To compare the UV, UV, UV and CD properties of heat-resistant type MMLV RT (WT), wild-type MMLV RT (WT) and heat-resistant type MMLV RT (E286R, E302K, L435R, D524A, MM4). The heat resistant type has the same shape as the heat resistant type. The affinity of each RT is evaluated by T/P. T/P-RT complex dissociation number is different from T/P-RT affinity The activity of RNase H was evaluated. The WT RNA was decomposed 15 seconds after the start of the reaction, and the heat-resistant RNA was decomposed 40 minutes after the start of the reaction. RNase H activity was changed from D524A to MM4, from E286R to E302K to L435R, from D524A to MM4, from E302K to L435R. E286R, E302K, L435R heat resistant, D524A, MM4 and the same RNase H activity loss causes NRTI resistance varies according to the introduction of Q84D, V223I, N249W, and the legality of reverse transcription. In the presence of four kinds of dNTPs and three kinds of dNTPs, the products of Q84D, V223I and N249W are produced by wild-type enzymes. NRTI tolerance varies according to the different Q84D, V223I, N249W and MMLV RT's validity. Dr. Menendez-Arias (Centro de Biologia Molecular "Severo Ochoa", Madrid, Spain) received guidance on the legality of reverse transcription (January 12-February 12). After the test, the test method was used to determine the performance of the test system. Now, this study is directed at other researchers.