人工ヌクレアーゼを用いた標的遺伝子組換えメダカ作出技術の確立

DNAシークエンス技術の発達に伴い、ゲノム情報の整備が急速に進む中、個々の遺伝子の機能を個体レベルで詳細に解析するための逆遺伝学的手法の重要性は増大しつつある。本研究では、任意のゲノムDNAを切断可能な人工ヌクレアーゼを用いて、メダカでの胚における標的遺伝子組換え技術を確立することを目的とした。本年度は前年度に引き続き、CRISPR/Casシステムによる標的遺伝子組み換えの高効率化のための条件検討を行った。本研究では、骨格筋特異的に強く発現するOlMA1遺伝子への標的遺伝子組換えによるGFP遺伝子の導入をモデル実験として、導入効率の比較検討を進めた。始めに、特に再現性において問題となった部分として、ドナーDNAへのRNaseの混入、及び転写RNAへのDNaseの混入の2点について、それぞれProteinase処理の追加や精製キットの変更を行った。続いて、必要な各核酸の導入量や導入に用いるドナーベクター中の相同配列の長さ、相同配列を露出させるためのBait配列について、導入効率に及ぼす影響を比較検討し、ある程度効率的に標的遺伝子組換えを行うためのプロトコルを確立しつつある。現在、当初計画の通り、更なる相同組換え効率の上昇を期待して、DNA二重鎖切断修復に関わる分子の操作についても検討を進めている。

DNAシークエンス技術の発達に伴い、ゲノム情報の整備が急速に進む中、個々の遺伝子の機能を個体レベルで詳細に解析するための逆遺伝学的手法の重要性は増大しつつある。本研究では、任意のゲノムDNAを切断可能な人工ヌクレアーゼを用いて、メダカでの胚における標的遺伝子組換え技術を確立することを目的とした。本年度は前年度に引き続き、CRISPR/Casシステムによる標的遺伝子組み換えの高効率化のための条件検討を行った。本研究では、骨格筋特異的に強く発現するOlMA1遺伝子への標的遺伝子組換えによるGFP遺伝子の導入をモデル実験として、導入効率の比較検討を進めた。始めに、特に再現性において問題となった部分として、ドナーDNAへのRNaseの混入、及び転写RNAへのDNaseの混入の2点について、それぞれProteinase処理の追加や精製キットの変更を行った。続いて、必要な各核酸の導入量や導入に用いるドナーベクター中の相同配列の長さ、相同配列を露出させるためのBait配列について、導入効率に及ぼす影響を比較検討し、ある程度効率的に標的遺伝子組換えを行うためのプロトコルを確立しつつある。現在、当初計画の通り、更なる相同組換え効率の上昇を期待して、DNA二重鎖切断修復に関わる分子の操作についても検討を進めている。