ゲノムマイニングに基づく異宿主発現による新規ラッソペプチドの生産

ラッソペプチドとは、その構造的特徴から命名された抗菌ペプチドのグループの名称で、ラッソペプチドは主にαプロテオバクテリア、大腸菌および放線菌から発見されてきた。構造の特徴は、20-30残基のアミノ酸からなるペプチドにおいてN末端のアミノ基が、N末から9-10残基目に存在するアスパラギン酸もしくはグルタミン酸の側鎖のカルボキシル基とペプチド結合を形成し、“輪”を形成する。さらにC末端の直鎖部分が輪の中を貫通するという特異 な立体構造を有しており、その構造が“投げ輪”に似ているためラッソペプチドと呼ばれている。その生合成は非常にシンプルでありゲノム情報から生合成遺伝子の予測が容易である。そこで、バクテリアのゲノム情報から、生合成遺伝子クラスターの検索を行った。昨年度見出した菌株に加えて、プロテオバクテリアSphingomonas koreensis NBRC16723株のゲノム情報に、新規ラッソペプチドの生合成遺伝子クラスターを見出した。そこで、生合成遺伝子クラスターの全長をPCR法を用いて増幅した。増幅した断片は、制限酵素で消化し、以前に開発した発現用シャトルベクターpHSG396Spに組み込んだ。大腸菌を用いてクローニングを行った。単離したプラスミドをエレクトロポレーションを行い、生産菌のSphingomonas subterranea NBRC 16086株に遺伝子導入することに成功した。異宿主生産を行うための培養実験をおこない、新規ラッソペプチド生産することに成功した。その化学構造に関して、ESI-MSおよびNMRを用いた構造解析を行い、三次元立体化学を含む構造の解析に成功した。現在、抗菌活性試験を行っている段階である。

ラッソペプチドとは、その構造的特徴から命名された抗菌ペプチドのグループの名称で、ラッソペプチドは主にαプロテオバクテリア、大腸菌および放線菌から発見されてきた。構造の特徴は、20-30残基のアミノ酸からなるペプチドにおいてN末端のアミノ基が、N末から9-10残基目に存在するアスパラギン酸もしくはグルタミン酸の側鎖のカルボキシル基とペプチド結合を形成し、“輪”を形成する。さらにC末端の直鎖部分が輪の中を貫通するという特異 な立体構造を有しており、その構造が“投げ輪”に似ているためラッソペプチドと呼ばれている。その生合成は非常にシンプルでありゲノム情報から生合成遺伝子の予測が容易である。そこで、バクテリアのゲノム情報から、生合成遺伝子クラスターの検索を行った。昨年度見出した菌株に加えて、プロテオバクテリアSphingomonas koreensis NBRC16723株のゲノム情報に、新規ラッソペプチドの生合成遺伝子クラスターを見出した。そこで、生合成遺伝子クラスターの全長をPCR法を用いて増幅した。増幅した断片は、制限酵素で消化し、以前に開発した発現用シャトルベクターpHSG396Spに組み込んだ。大腸菌を用いてクローニングを行った。単離したプラスミドをエレクトロポレーションを行い、生産菌のSphingomonas subterranea NBRC 16086株に遺伝子導入することに成功した。異宿主生産を行うための培養実験をおこない、新規ラッソペプチド生産することに成功した。その化学構造に関して、ESI-MSおよびNMRを用いた構造解析を行い、三次元立体化学を含む構造の解析に成功した。現在、抗菌活性試験を行っている段階である。