Cofactor-Mediated DNA Binding by the NF-kappaB Dimers

点击翻译按钮获取中文摘要

Project Summary  The  NF-­  κB  dimers  bind  to  specific  DNA  response  elements  known  as  the  κB  DNA  sites  located  in  the  promoters and enhancers of thousands of genes, and regulate their expression. Although the roughly 10 bp  long  κB  sequences  follow  a  consensus, hundreds  of  specific  sequences  can  fit  the  consensus.  Sequence  variations  can  result  in  differences  in  NF-­κB-­DNA  binding  affinity,  kinetics  and  conformations  leading  to  changes  in  transcriptional  output.  Indeed,  other  and  we  reported  that  as  few  as  a  single  bp  change  can  have severe effect in gene regulation by the NF-­κB dimers. Affinities of the NF-­κB:DNA complexes derived  from  in  vitro  experiments  do  not  always  correlate  with  in  vivo  binding  and  gene  regulation.  These  observations  suggest  that  there  are  modulators  present  in  the  cell  and  without  their  inclusion  in  in  vitro  experiments  in  vivo  and  in  vitro  results  will  not  reconcile.  On  the  other  hand,  without  proper  in  vitro  experimental  set  up,  proper  investigation  of  regulatory  mechanisms  in  vivo  is  difficult  to  accomplish.  Cellular  experiments  performed  over  the  past  10  years  established  the  presence  of  several  of  such  modulators,  but  their  mechanisms  of  action  could  not  be  properly  explained  without  thorough  biochemical  and  biophysical  experiments.  We  term  these  modulators  cofactors.  These  cofactors  alter  the  DNA  binding  affinity  of  NF-­κB  p50:RelA  heterodimer  and  RelA  homodimers  in  a  κB  sequence-­specific  manner.  The  focus  of  this  proposal  is  to  use  new  experiments  to  propose  a  unifying  principle  of  how  the  cofactors  regulate NF-­κB activity.   We  propose  that  when  the  affinity  between  an  NF-­κB:κB  DNA  complex  is  weak,  a  cofactor  can  act  positively  enhancing  the  affinity  of  NF-­κB:DNA  complexes  by  directly  contacting  NF-­κB  without  contacting  DNA  allowing  gene expression  to occur. Alternatively, a  cofactor  can act  negatively  by  removing  NF-­κB  off  the  DNA  (or  reduce  affinity).  Several  positive  cofactors  and  few  negative  cofactors  are  known.  We  will  investigate  the  mode  of  actions  of  a  few  of  these  cofactors  in  vitro.  Specifically,  we  will  identify  the  site  of  interaction of both  positive  and  negative  cofactors  on  RelA and how they use  allosteric  mechanism to alter  DNA binding by RelA. Since no cofactor specific to p50 is known, we also plan to identify cofactors specific  to the p50 subunit and investigate if and how these new cofactors act together with RelA-­specific cofactors.  We  will  generate  mutants  of  RelA  defective  in  cofactor  binding  and  test  how  gene  expression  profile  and  DNA binding in cells alters in response to specific stimulus.