Cofactor-Mediated DNA Binding by the NF-kappaB Dimers

NF-kappaB 二聚体辅助因子介导的 DNA 结合

• 批准号: 9887959
• 负责人: GOURISANKAR GHOSH
• 金额: $ 31.44万
• 依托单位: UNIVERSITY OF CALIFORNIA, SAN DIEGO
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2009
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2009-07-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/9887959
• 关键词: Affect; Affinity; Binding; Biochemical; Biological; Biology; Biophysics; Cartoons; Cells; Cellular Immunity; Communication; Complex; Consensus; DNA; DNA Binding; DNA Sequence; Data; Disease; Dissociation; Enhancers; Equilibrium; Family; Gene Activation; Gene Expression; Gene Expression Profile; Gene Expression Regulation; Genes; Genetic Transcription; Genomic DNA; Glean; Goals; IRF3 gene; Immunity; In Vitro; Inflammation; Inflammatory; Interleukin-1; Interleukins; Investigation; Kinetics; Knowledge; Mediating; Modeling; Molecular; Molecular Conformation; NF-kappa B; Nuclear Proteins; Output; Process; Proteins; Regulator Genes; Reporting; Research; Research Personnel; Response Elements; Retinoblastoma; Retinoblastoma Protein; Ribosomal Proteins; SRC-associated p68 protein; Site; Solid; Specificity; Stimulus; TNFRSF5 gene; TP53 gene; Testing; Transcriptional Regulation; Tumor Suppressor Proteins; Variant; Work; cofactor; combat; dimer; experimental study; genome-wide; in vivo; insight; link protein; member; mutant; negative affect; novel therapeutic intervention; peptidomimetics; programs; promoter; recruit; response; retinoblastoma tumor suppressor; transcription factor

Project Summary  The  NF-­  κB  dimers  bind  to  specific  DNA  response  elements  known  as  the  κB  DNA  sites  located  in  the  promoters and enhancers of thousands of genes, and regulate their expression. Although the roughly 10 bp  long  κB  sequences  follow  a  consensus, hundreds  of  specific  sequences  can  fit  the  consensus.  Sequence  variations  can  result  in  differences  in  NF-­κB-­DNA  binding  affinity,  kinetics  and  conformations  leading  to  changes  in  transcriptional  output.  Indeed,  other  and  we  reported  that  as  few  as  a  single  bp  change  can  have severe effect in gene regulation by the NF-­κB dimers. Affinities of the NF-­κB:DNA complexes derived  from  in  vitro  experiments  do  not  always  correlate  with  in  vivo  binding  and  gene  regulation.  These  observations  suggest  that  there  are  modulators  present  in  the  cell  and  without  their  inclusion  in  in  vitro  experiments  in  vivo  and  in  vitro  results  will  not  reconcile.  On  the  other  hand,  without  proper  in  vitro  experimental  set  up,  proper  investigation  of  regulatory  mechanisms  in  vivo  is  difficult  to  accomplish.  Cellular  experiments  performed  over  the  past  10  years  established  the  presence  of  several  of  such  modulators,  but  their  mechanisms  of  action  could  not  be  properly  explained  without  thorough  biochemical  and  biophysical  experiments.  We  term  these  modulators  cofactors.  These  cofactors  alter  the  DNA  binding  affinity  of  NF-­κB  p50:RelA  heterodimer  and  RelA  homodimers  in  a  κB  sequence-­specific  manner.  The  focus  of  this  proposal  is  to  use  new  experiments  to  propose  a  unifying  principle  of  how  the  cofactors  regulate NF-­κB activity.   We  propose  that  when  the  affinity  between  an  NF-­κB:κB  DNA  complex  is  weak,  a  cofactor  can  act  positively  enhancing  the  affinity  of  NF-­κB:DNA  complexes  by  directly  contacting  NF-­κB  without  contacting  DNA  allowing  gene expression  to occur. Alternatively, a  cofactor  can act  negatively  by  removing  NF-­κB  off  the  DNA  (or  reduce  affinity).  Several  positive  cofactors  and  few  negative  cofactors  are  known.  We  will  investigate  the  mode  of  actions  of  a  few  of  these  cofactors  in  vitro.  Specifically,  we  will  identify  the  site  of  interaction of both  positive  and  negative  cofactors  on  RelA and how they use  allosteric  mechanism to alter  DNA binding by RelA. Since no cofactor specific to p50 is known, we also plan to identify cofactors specific  to the p50 subunit and investigate if and how these new cofactors act together with RelA-­specific cofactors.  We  will  generate  mutants  of  RelA  defective  in  cofactor  binding  and  test  how  gene  expression  profile  and  DNA binding in cells alters in response to specific stimulus.

项目摘要 NF-κ B B二聚体与特定的DNA反应元件结合，称为κB DNA位点，位于 启动子和增强子的成千上万的基因，并调节其表达。虽然大约10 bp的 长κB序列遵循一个共有序列，数百个特定序列可以符合该共有序列。 变异可导致NF-κB B-κ B DNA结合亲和力、动力学和构象的差异， 事实上，其他人和我们报告说，只要一个bp的变化， 在NF-κB二聚体的基因调控中有严重的影响。 来自体外实验的结合并不总是与体内结合和基因调控相关。 观察结果表明，在细胞中存在调节剂，而在体外不包含它们。 体内实验和体外实验的结果将不一致。另一方面，没有适当的体外实验， 在实验设置中，很难完成体内调节机制的适当研究。 在过去10年中进行的细胞实验确定了几种这样的存在。 调节剂，但它们的作用机制不能得到适当的解释，没有彻底的生化 我们称这些调节因子为辅助因子。这些辅助因子改变DNA结合 NF-κB p50的亲和力：以κB序列特异性方式的RelA异二聚体和RelA同二聚体。 这项建议的重点是使用新的实验提出一个统一的原则，如何辅因子 调节NF-κ B B活性。 我们认为当NF-κB：κB DNA复合物之间的亲和力较弱时，辅因子可以起作用 通过直接接触NF-κ B而不接触DNA， 或者，辅因子可以通过去除NF-κB B而起负面作用， 已知几种阳性辅因子和几种阴性辅因子。我们将 研究这些辅助因子在体外的作用模式。具体来说，我们将确定 RelA上正性和负性辅因子的相互作用以及它们如何利用变构机制改变 由于没有已知的p50特异性辅因子，我们还计划鉴定p50特异性辅因子。 p50亚基，并研究这些新的辅因子是否以及如何与RelA β特异性辅因子一起作用。 我们将产生辅因子结合缺陷的RelA突变体，并测试基因表达谱和 细胞中的DNA结合会对特定的刺激做出反应。