Understanding fibrin-mediated immunomodulation in wound healing

项目摘要 手术、创伤性损伤、糖尿病和代谢综合征造成的急性和慢性伤口的发生率是 仅在美国就有超过300万人受到影响，每年造成数百亿美元的损失。 成功的伤口愈合经历凝血/炎症、增殖和重塑阶段， 最终导致组织再生和/或收缩和结疤。 巨噬细胞是重要的介质， 通过这些阶段的进展，并响应于外部治疗调节。 然而，可溶性和 介导巨噬细胞与这些材料和其它伤口效应物相互作用的机械因素仍然存在 大部分未知。我建议使用免疫学和生物工程方法来改进我们的工具， 填补这一未满足的临床需求。 我们以前的工作表明，纤维蛋白，临时的主要成分， 细胞外基质，使小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDM）倾向于抗炎 表型，抑制定型的细胞因子对强效炎症刺激，包括LPS的反应。 来自小鼠5 mm全厚皮肤伤口的初步数据显示伤口中的抗炎性偏斜， 通过巨噬细胞中精氨酸酶、iNOS和雅普表达测量，并减少肌成纤维细胞标记物α 平滑肌肌动蛋白（aSMA）与纤维蛋白处理，表明巨噬细胞-成肌纤维细胞相互作用的作用 在伤口里此外，软（1.2 kPa）和硬（840 kPa）凝胶均显示出增加巨噬细胞 在定型异物反应中观察到的炎性细胞因子分泌（例如TNF α）， 硬度显示较低的分泌，表明免疫调节的机械最佳点。 我建议 工程化纤维蛋白-PEG水凝胶，针对巨噬细胞免疫调节能力进行了机械优化， 将它们与体外共培养物共培养，以确定巨噬细胞-成纤维细胞-纤维蛋白相互作用的动力学， 中等硬度（~140 kPa）的纤维蛋白水凝胶最能促进抗炎巨噬细胞 表型，促进肌成纤维细胞收缩性降低。我的目标还在于确定纤维蛋白 水凝胶调节巨噬细胞表型，以实现体内伤口愈合和再生，使用全 野生型的厚皮肤创伤模型和选择性免疫细胞耗竭模型（巨噬细胞-巨噬细胞MAFIA， clodrosome;嗜中性粒细胞-β-抗β-GR 1，B-β-细胞-β-抗β-CXCL 13）。我会用组织学流式细胞术和RNA测序 中等硬度（~140 kPa）的纤维蛋白-PEG水凝胶将加速伤口消退的假设， 组织再生通过促进抗炎巨噬细胞表型。 了解调解人 纤维蛋白酶促进伤口愈合将有助于我们更好地理解生理性伤口修复， 为合理设计新疗法和更好地护理患者伤口奠定基础。

PROJECT SUMMARY    The incidence of acute and chronic wounds from surgery, traumatic injury, diabetes, and metabolic syndrome is  on  the  rise,  affecting  over  three  million  people  in  the  US  alone  and  costing  tens  of  billions  of  dollars  a  year.   Successful wound healing progresses through coagulation/inflammation, proliferation, and remodeling phases,  culminating  in  tissue  regeneration  and/or  contraction  and  scarring.  Macrophages  are  essential  mediators  of  progression  through  these  stages,  and  responsive  to  external  therapeutic  modulation.  Yet,  the  soluble  and  mechanical factors mediating macrophage interactions with these materials and other wound effectors remain  largely unknown. I propose to use immunology and bioengineering approaches to improve our tools and work to  fill  this  unmet  clinical  need.  Our  previous  work  demonstrated  that  fibrin,  a  major  component  of  the  provisional  extracellular  matrix,  skews  murine  bone  marrow  derived  macrophages  (BMDM)  towards  an  anti-­inflammatory  phenotype in vitro, suppressing the stereotyped cytokine response to potent inflammatory stimuli, including LPS.  Preliminary  data  from  5  mm  full-­thickness  skin  wounds  in  mice  showed  anti-­inflammatory  skew  in  the  wound,  measured by Arginase, iNOS, and YAP expression in macrophages, and diminished myofibroblast marker alpha  smooth muscle actin (aSMA) with fibrin treatment, suggesting a role for macrophage-­myofibroblast interactions  in the wound. Additionally, both soft (1.2 kPa) and stiff (840kPa) gels have been shown to increase macrophage  secretion of inflammatory cytokines seen in the stereotyped foreign body response (e.g. TNFa), with intermediate  stiffness  showing  lower  secretion,  indicating  a  mechanical  sweet  spot  for  immunomodulation.  I  propose  to  engineer fibrin-­PEG hydrogels, mechanically optimized for macrophage immunomodulatory capacity, and apply  them to in vitro cocultures to determine macrophage-­fibroblast-­fibrin interaction dynamics and test the hypothesis  that  fibrin  hydrogels  of  moderate  stiffness  (~140  kPa)  will  best  promote  anti-­inflammatory  macrophage  phenotype, facilitating decreased myofibroblast contractility. I also aim to define the mechanisms by which fibrin  hydrogels  modulate  macrophage  phenotype  to  achieve  wound  healing  and  regeneration  in  vivo,  using  a  full  thickness  skin  wound  model  in  wild  type,  and  selective  immune  cell  depletions  models  (macrophage-­  MAFIA,  clodrosome;; neutrophil-­ anti-­GR1, B-­cell-­anti-­CXCL13). I will use histology, flow cytometry, and RNA-­seq to test  the hypothesis that fibrin-­PEG hydrogels of moderate stiffness (~140 kPa) will accelerate wound resolution and  tissue  regeneration  by  promoting  anti-­inflammatory  macrophage  phenotype.  Understanding  the  mediators  of  fibrin-­enhanced  wound  healing  will  help  us  better  understand  physiologic  wound  repair,  and  will  lay  the  groundwork for rational design of novel therapeutics, and better wound care for patients.