CYT STRUCTURE-FUNCTION VIA SITE-DIRECTED MUTAGENESIS
通过定点诱变的 CYT 结构-功能
基本信息
- 批准号:3283847
- 负责人:
- 金额:$ 9.83万
- 依托单位:
- 依托单位国家:美国
- 项目类别:
- 财政年份:1985
- 资助国家:美国
- 起止时间:1985-09-20 至 1986-08-31
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:acidity /alkalinity chemical structure function cytochrome c fungal genetics genetic manipulation heme hemoprotein structure high performance liquid chromatography hydrogen bond iron ligands molecular cloning nuclear magnetic resonance spectroscopy oligonucleotides stop flow technique tissue /cell culture yeasts
项目摘要
Although cytochrome c has been studied extensively since its rediscovery by
Kelin in the 1920s, many uncertainties remain regarding the manner in which
its functional properties are determined by its structure. These questions
remain largely from the inability of chemical modification techniques to
probe many types of amino acid residues and from the structural ambiguities
that invariably occur in comparative studies of proteins from different
species. Recent advances in molecular genetics now provide a new method of
addressing these concerns through the application of
oligodexyribonucleotide-directed site-specific mutagenesis. This approach,
in principle, permits the replacement of any residue in any position of the
protein sequence with any other naturally occurring amino acid residue if a
functional clone of the gene coding for the protein is available.
Previous work in our laboratories has employed or, in fact, developed all
of the genetic and physical techniques relevant to this proposal. This
experience will now be directed to preparing and characterizing the
functional properties of five types of mutant yeast iso-l-cytochromes c
which we have classified on the basis of the functional features of the
protein that they are designed to probe. These classes of mutants include
axial ligand mutants, heme thioether linkage mutans, hydrogen-bonding
mutants, redox partner recognition mutants, and high-pH transition mutants.
Initial studies in our laboratories have demonstrated that these techniques
can readily generate 15-30 mg of mutant protein from 20 L cultures of yeast
and have demonstrated that mutant cytochromes produced by these techniques
provide a powerful means for studying the effect of cytochrome structure on
the function of the protein. Combined, the initial results reported
unambiguously demonstrate the feasibility and potential productivity of the
work proposed.
尽管自细胞色素c被重新发现以来,人们对其进行了广泛的研究
凯林在20世纪20年代,关于以何种方式
其功能特性由其结构决定。这些问题
仍然在很大程度上是由于化学修饰技术无法
从结构歧义看多种氨基酸残基
这在对来自不同物种的蛋白质的比较研究中总是发生的
物种。分子遗传学的最新进展现在提供了一种新的方法
通过应用
寡聚脱氧核糖核苷酸定点突变。这种方法,
原则上,允许替换
蛋白质序列与任何其他自然存在的氨基酸残基,如果
对编码该蛋白质的基因进行功能克隆是可行的。
我们实验室以前的工作已经或事实上发展了所有的
与这项提议相关的遗传和物理技术。这
经验现在将被引导到准备和表征
五种突变酵母异L细胞色素c的功能特性
我们根据其功能特点对其进行分类
它们被设计用来探测的蛋白质。这些类别的突变体包括
轴向配体突变体,血红素硫醚键突变体,氢键
突变体、氧化还原伙伴识别突变体和高pH转变突变体。
我们实验室的初步研究表明,这些技术
可以很容易地从20种L酵母培养物中产生15-30毫克突变蛋白
并证明了通过这些技术产生的突变细胞色素
为研究细胞色素结构对细胞毒性的影响提供了有力的手段
蛋白质的功能。综合起来,报告的初步结果
毫不含糊地证明
建议的工作。
项目成果
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专著数量(0)
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