Cryo-EM studies of a metazoan replisome captured ex vivo during elongation and termination

在延伸和终止过程中离体捕获的后生动物复制体的冷冻电镜研究

基本信息

  • 批准号:
    BB/Y006232/1
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 67.93万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    英国
  • 项目类别:
    Research Grant
  • 财政年份:
    2024
  • 资助国家:
    英国
  • 起止时间:
    2024 至 无数据
  • 项目状态:
    未结题

项目摘要

Our bodies are built-up of trillions of cells. Over time, our cells age and become damaged, so a subset of cells in our bodies keep dividing, creating replacements. Before each cell division, every cell must first duplicate its genome - all of it, just once and without mistakes. Mistakes during DNA replication, which are not timely repaired, can lead to mutations and genetic changes that in turn can lead to problems with cell proliferation, aging, and development of cancer. Most of the cancer-driving mutations result from random mistakes during the process of DNA replication. Moreover, hereditary mutations in components of the DNA replication machinery cause a set of disorders characterised by small posture and small brain due to the inability to create enough cells to develop a normal-sized human being. Replicating all of our DNA is a huge task - we have about 2 metres of DNA in each of our cells, and it is compacted in a highly organised way to fit into the nucleus in a manner that enables proteins to access any needed DNA sequences. During DNA replication this structure must be unwound, duplicated, and compacted again. To replicate all DNA, the process of DNA replication starts from about 50 thousand start sites with about 100 thousand individual replication machineries (replisomes) replicating DNA. Ever since Watson and Crick proposed the first model of DNA replication 70 years ago, researchers aim to understand how this process is coordinated, regulated, and delivered without mistakes.In eukaryotic cells, the replication machinery is composed of hundreds of proteins that must be precisely organised to coordinate all their functions together. Our previous work has shown that the core of the replisome is organised around the replicative helicase (CMG complex). The replicative helicase can unwind double-stranded DNA to provide the template for synthesis of the complementary strands. Over the last 15 years, structural biology findings have produced the first structures of reconstituted helicase providing a great breakthrough into our understanding of how some of the components of the replication machinery are working together. However, almost all the solved complexes were assembled in vitro from purified proteins. This approach is obviously very successful, but it requires pre-determined known factors that are assumed to form the complex of interest, potentially missing additional or minor partners that could affect the overall structure of the complex. Moreover, the molecular machineries involved in these processes are naturally assembled on a chromatinised substrate and are tightly regulated. Since reconstituted complexes are assembled in vitro, elements of that regulation are missing, thus potentially leading to incomplete or misleading observations. Finally, most of the solved structures are reconstituted from budding yeast proteins, which are not identical to proteins from human or other higher eukaryotic organisms. We propose here to optimize an alternative method to isolate protein complexes essential for DNA replication using Xenopus laevis egg extract, which is the only higher eukaryote cell-free system containing all the factors involved in DNA replication. The purified protein complexes will be analysed via structural microscopy techniques and biochemical approaches delivering the first ever naturally (ex vivo) assembled structures of a replicative helicase and the replisome. We will biochemically validate our structures and compare them to the existing in vitro assembled structures from other species. Moreover, using our expertise of working with this system, we can use various inhibitors to "freeze" the replication machinery in various configurations: active, stalled, terminated. We will solve their structures and compare them, to understand the dynamic changes that occur to the replisome as it transitions through these states.
我们的身体是由数万亿个细胞组成的。随着时间的推移,我们的细胞老化并受损,所以我们体内的一部分细胞不断分裂,产生新的细胞。在每个细胞分裂之前,每个细胞都必须首先复制它的基因组——所有的基因组,只有一次,而且没有错误。DNA复制过程中的错误,如果不能及时修复,就会导致突变和基因变化,进而导致细胞增殖、衰老和癌症的发生。大多数癌症驱动突变是由于DNA复制过程中的随机错误造成的。此外,由于无法产生足够的细胞来发育正常大小的人类,DNA复制机制组成部分的遗传突变会导致一系列以小姿态和小大脑为特征的疾病。复制我们所有的DNA是一项艰巨的任务——我们每个细胞中大约有2米长的DNA,它以一种高度有序的方式被压缩,以适应细胞核,从而使蛋白质能够访问任何所需的DNA序列。在DNA复制过程中,这个结构必须解开,复制,并再次压缩。为了复制所有的DNA, DNA复制过程从大约5万个起始点开始,大约有10万个复制机器(复制体)在复制DNA。自从沃森和克里克在70年前提出第一个DNA复制模型以来,研究人员就致力于了解这个过程是如何协调、调节和无误地传递的。在真核细胞中,复制机制由数百种蛋白质组成,这些蛋白质必须精确地组织起来才能协调它们的所有功能。我们之前的工作表明,复制体的核心是围绕复制解旋酶(CMG复合体)组织的。复制解旋酶可以解开双链DNA,为互补链的合成提供模板。在过去的15年里,结构生物学的发现已经产生了第一个重组解旋酶的结构,为我们理解复制机制的一些组成部分如何协同工作提供了一个巨大的突破。然而,几乎所有解决的配合物都是由纯化的蛋白质在体外组装的。这种方法显然非常成功,但它需要预先确定的已知因素,假设这些因素形成感兴趣的复合体,可能会遗漏可能影响复合体整体结构的其他或次要伙伴。此外,参与这些过程的分子机制是在染色质化的底物上自然组装的,并受到严格调节。由于重组的复合物是在体外组装的,因此缺乏这种调节的要素,因此可能导致不完整或误导性的观察结果。最后,大多数解决的结构是由出芽酵母蛋白重建的,这与人类或其他高等真核生物的蛋白质不相同。我们在此建议优化一种替代方法,利用非洲爪蟾卵提取物分离DNA复制所必需的蛋白质复合物,这是唯一一种包含所有DNA复制相关因子的高等真核生物无细胞系统。纯化的蛋白质复合物将通过结构显微镜技术和生化方法进行分析,从而首次自然(离体)组装复制解旋酶和复制体的结构。我们将生化验证我们的结构,并将它们与其他物种的体外组装结构进行比较。此外,利用我们与该系统合作的专业知识,我们可以使用各种抑制剂来“冻结”各种配置的复制机制:活跃的,停滞的,终止的。我们将解决它们的结构,并对它们进行比较,以了解复制体在这些状态转换时发生的动态变化。

项目成果

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    Alice L. B. Pyne
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  • 影响因子:
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  • 作者:
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    G. Stewart

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