FUNCTIONAL ANALYSIS OF DENGUE NONSTRUCTURAL PROTEINS, NS2B AND NS3

登革热非结构蛋白 NS2B 和 NS3 的功能分析

• 批准号: 3790793
• 负责人: C J LAI
• 金额: --
• 依托单位: NATIONAL INSTITUTE OF ALLERGY AND INFECTIOUS DISEASES
• 依托单位国家: 美国
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 至
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/3790793
• 关键词: active sites; chemical cleavage; dengue virus; endopeptidases; genetic manipulation; mutant; polymerase chain reaction; protein sequence; protein structure function; recombinant DNA; restriction fragment length polymorphism; virus genetics; virus protein

We previously showed that the NS3 protease domain is required for NS2A/NS2B and NS2B/NS3 cleavage. In addition, we shoed that NS2B is also required for NS2A/NS2B, NS2B/NS3 and NS3/NS4A cleavage, and that NS2B can function in trans. DEN4 NS2B contains 130 amino acids, most of which are hydrophobic. We have proposed that NS2B plus NS3 interact to form a two component protease. Using polymerase chain reaction (PCR), we introduced seven new unique restriction enzyme sites into NS2B (5'-Nhe I, Stu I, Afl II, Apa I, Nru I, Spe I, Bst EII-3'). These new sites did not change the amino acid sequence of NS2B. In addition to the seven unique sites introduced, there is a unique Bgl II site in NS2B, located between the Apa I and Nru I sites. Oligonucleotides were used to bridge between the nearest-neighbor pairs of all 8 sites, creating seven internal deletion mutants of NS2B. Additional recombinants designed to further define the critical residues of NS2B have also been constructed. Analysis of this series of deletion mutants showed that a 40 amino acid domain is sufficient to mediate cleavage of the resulting NS2B-NS3 polyprotein. The critical NS2B sequence contains several charged amino acid residues, presumably important for interactions with the NS3 protease components.

我们之前表明 NS3 蛋白酶结构域是 NS2A/NS2B 所必需的 和 NS2B/NS3 裂解。 另外，我们还需要NS2B 对于 NS2A/NS2B、NS2B/NS3 和 NS3/NS4A 裂解，并且 NS2B 可以发挥作用 反式。 DEN4 NS2B 含有 130 个氨基酸，其中大部分是 疏水性的。 我们提出 NS2B 和 NS3 相互作用形成两个 成分蛋白酶。 使用聚合酶链反应（PCR），我们介绍了 NS2B 中七个新的独特限制性内切酶位点（5'-Nhe I、Stu I、Afl II、Apa I、Nru I、Spe I、Bst EII-3'）。 这些新网站并没有改变 NS2B的氨基酸序列。 除了七个独特的地点 介绍一下，NS2B中有一个独特的Bgl II位点，位于Apa之间 I 和 Nru I 站点。 寡核苷酸被用来桥接 所有 8 个站点的最近邻对，创建 7 个内部删除 NS2B的突变体。 额外的重组体旨在进一步定义 NS2B 的关键残基也已构建。 对此的分析 一系列缺失突变体表明 40 个氨基酸结构域就足够了 介导所得 NS2B-NS3 多蛋白的裂解。 关键的 NS2B 序列含有几个带电氨基酸残基，推测 对于与 NS3 蛋白酶成分的相互作用很重要。