MAPPING ITAM PHOSPHORYLATION SITES BY MASS SPECTROMETRY

通过质谱绘制 ITAM 磷酸化位点

• 批准号: 6352435
• 负责人: KAREN R JONSCHER
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: UNIVERSITY OF COLORADO
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 2000-01-01 至
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/6352435
• 关键词: B lymphocyte; T cell receptor; leukocyte activation /transformation; mass spectrometry; method development; phosphoproteins; phosphorylation; protein structure function; stoichiometry

B and T cell antigen receptors, certain receptors for immunoglobulin Fc regions and some viral proteins contain one or more copies of a approximately 26 amino acid motiftermed immunoreceptor-based tyrosine activation motif (ITAM) utilized for communication with cytoplasmic effectors during signal transduction. We propose to use matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) time-of-flight (TOF) mass spectrometry to directly map the sites and determine the stoichiometry of phosphorylation of the ITAM-containing transducer components of the B cell receptor complex, Ig-alpha and Ig-beta. The studies will extend preliminary findings that the tyrosines in Ig-alpha and Ig-beta ITAMS are asymmetrically phosphorylated by various Src-family kinases in vitro and findings that suggest the asymmetry results in unique biological responses of B cells. The studies will assess whether asymmetrical ligand-induced tyrosine phosphorylation occurs as a function of B cell maturity and/or antigen affinity and valency. Immature and mature B cells from transgenic 3-83 mice will be stimulated with antigen, lysed and ITAMs immunoprecipitated using anti-Ig-alpha. Following SDS-PAGE separation and electroblotting onto nitrocellulose, strips representing Ig-alpha and Ig-beta bands will be excised, in situ enzymatic digests will be performed, and peptides extracted. MALDI-TOF win be used to map phosphorylation sites by postsource decay (PSD) analysis. Protein purification and mass spectrometric parameters will be optimized using synthetic ITAM peptides and chimeric mutants.

B 和 T 细胞抗原受体、免疫球蛋白 Fc 的某些受体 区域和一些病毒蛋白含有一个或多个拷贝 大约 26 个氨基酸基序，称为基于免疫受体的酪氨酸 激活基序（ITAM）用于与细胞质通讯 信号转导过程中的效应器。 我们建议使用矩阵辅助 激光解吸电离 (MALDI) 飞行时间 (TOF) 质量 光谱法直接绘制位点图并确定化学计量 含 ITAM 的转导元件的磷酸化 B 细胞受体复合物、Ig-α 和 Ig-β。 研究将延伸 初步发现 Ig-alpha 和 Ig-beta ITAMS 中的酪氨酸 在体外被各种 Src 家族激酶不对称磷酸化 以及表明不对称性导致独特的生物学结果的研究结果 B细胞的反应。 研究将评估是否不对称 配体诱导的酪氨酸磷酸化作为 B 细胞的功能而发生 成熟度和/或抗原亲和力和效价。 不成熟和成熟B 来自转基因 3-83 小鼠的细胞将用抗原刺激，裂解 和使用抗 Ig-α 进行免疫沉淀的 ITAM。 SDS-PAGE后 分离并电印迹到硝酸纤维素上，条带代表 Ig-α 和 Ig-β 带将被切除，原位酶消化 将进行，并提取肽。 MALDI-TOF win用于绘图 通过源后衰变 (PSD) 分析磷酸化位点。 蛋白质 纯化和质谱参数将使用优化 合成 ITAM 肽和嵌合突变体。