DYNAMICS OF PROTEIN-DNA INTERACTIONS IN DNA REPLICATION

DNA 复制中蛋白质-DNA 相互作用的动力学

• 批准号: 6180688
• 负责人: Linda B Bloom
• 金额: $ 18.25万
• 依托单位: UNIVERSITY OF FLORIDA
• 依托单位国家: 美国
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 美国
• 起止时间: 1998-07-01 至 2003-06-30
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://reporter.nih.gov/project-details/6180688
• 关键词: DNA directed DNA polymerase; DNA replication; adenosine triphosphate; bacteriophage T4; chemical kinetics; enzyme activity; fluorescence microscopy; intermolecular interaction; microorganism culture; molecular dynamics; protein protein interaction; virus DNA; virus genetics

DESCRIPTION: The long-term goal of this proposal is to better define dynamic protein-DNA and protein-protein interactions in DNA replication. The system that will be examined in detail is the loading of the sliding clamp (processivity factor) onto DNA by the multi-subunit clamp loader complex. The investigator proposes to examine this system from 2 different organisms, E. coli and T4. In Specific Aim 1, the investigator will examine how varying the structure of the DNA (DNA primer-template, RNA primer-template, blunt end, etc.) affects loading of the sliding clamp (beta) by the clamp loader complex (gamma complex). A novel fluorescence anisotropy-based binding assay will be used to identify protein-protein and protein-DNA interactions. A variety of different sub-complexes that can be isolated from pol III will be examined, including th tau complex. ATP dependent steps will be identified. In Specific Aim 2, pre-steady-state kinetic approaches will be used to define rate-limiting processes in loading and the order of events in loading. Interactions between beta and gamma will be examined, along with protein-DNA interactions. Steps that require either ATP binding or hydrolysis will be identified. Pre-steady-state primer extension assays will be used to differentiate between productive and non-productive beta-DNA complexes. In Specific Aim 3, similar experiments will be performed using the sliding clamp protein (gp45) and clamp loader complex (gp44/62) from phage T4 in order to define mechanistic similarities and differences between the two systems.

描述：该提案的长期目标是更好地定义 DNA 复制中的动态蛋白质-DNA 和蛋白质-蛋白质相互作用。 将详细检查的系统是滑动的载荷 通过多亚基夹具加载器将（持续生产因子）夹到 DNA 上 复杂的。 研究者建议从 2 个不同的方面来检查该系统 有机体、大肠杆菌和 T4。 在具体目标 1 中，研究者将检查 如何改变 DNA 的结构（DNA 引物模板、RNA 引物模板、钝端等）影响滑动夹具的负载 （β）由夹具装载复合体（伽玛复合体）。 一种新颖的荧光 基于各向异性的结合测定将用于识别蛋白质-蛋白质和 蛋白质-DNA 相互作用。 各种不同的子复合体可以 将检查从 pol III 中分离出来的病毒，包括 th tau 复合物。 ATP 将确定相关步骤。 在具体目标 2 中，稳态前 动力学方法将用于定义加载中的速率限制过程 以及加载中事件的顺序。 β 和 γ 之间的相互作用 将与蛋白质-DNA 相互作用一起进行检查。 需要的步骤 ATP 结合或水解将被识别。 前稳态 引物延伸测定将用于区分生产性和 非生产性 β-DNA 复合物。 在具体目标 3 中，类似的实验 将使用滑动夹蛋白 (gp45) 和夹钳装载机进行 来自噬菌体 T4 的复合物 (gp44/62)，以确定机械相似性 以及两个系统之间的差异。