Imaging Transcription in Living Animals

活体动物的成像转录

基本信息

  • 批准号:
    8446376
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 55.63万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    美国
  • 项目类别:
  • 财政年份:
    2012
  • 资助国家:
    美国
  • 起止时间:
    2012-04-01 至 2016-01-31
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

DESCRIPTION (provided by applicant): The goal of our application is to design and develop an experimental approach that will allow us to visualize transcription in real time within living tissues. The technology will combine expertise in optics, protein chemistry and molecular biology. Our approach will address key technical hurdles such as, i) fashioning an imaging beam capable of penetrating tissue and capturing the fluorescence signal emanating from it, ii) designing an RNA that will become tagged with a fluorescent marker when expressed in living tissue, iii) selecting a fluorescent tag with an emission wavelength that acts transparently in tissue and can be excited by two-photon absorption. We intend to visualize transcription of the beta-actin gene in tissues, since it has been well-characterized and constitutively expressed in all cells. We have engineered transgenic mice that harbor multiple MS2 stem-loop structures within genomic copies of the beta-actin gene. The stem-loops have a strong affinity for a capsid protein which is fused to a fluorescent reporter. Using two-photon microscopy we can observe the transcription in muscle and brain tissue, and furthermore our fluctuation analysis can tell us how many polymerases are engaged on the gene at any given time. The data we collect will allow us to determine the initiation, elongation, and termination rates of beta-actin transcription in each cell within the tissue. The methods devised by our approach will have broad applications and serve as a novel strategy in quantifying the levels of gene expression in tissues and more importantly to derive a model for gene expression in general that will be the basis for understanding how genes are regulated in different tissues, and among cells within the same tissue. Studying dynamics of a single gene in real time will lead to experiments directly testing hypotheses concerning the stochastic nature of gene activity during cell differentiation and homeostasis as well as deriving an approach to study disease genes.
描述(由申请人提供):我们申请的目标是设计和开发一种实验方法,该方法将允许我们在活组织内以真实的时间可视化转录。该技术将结合联合收割机在光学,蛋白质化学和分子生物学的专业知识。我们的方法将解决关键的技术障碍,例如,i)形成能够穿透组织并捕获从其发出的荧光信号的成像光束,ii)设计当在活组织中表达时将被荧光标记物标记的RNA,iii)选择具有在组织中透明地起作用并且可以通过双光子吸收激发的发射波长的荧光标记物。我们打算可视化β-肌动蛋白基因在组织中的转录,因为它已被充分表征,并在所有细胞中组成型表达。我们已经设计了在β-肌动蛋白基因的基因组拷贝内具有多个MS 2茎环结构的转基因小鼠。茎-环对与荧光报告基因融合的衣壳蛋白具有强亲和力。使用双光子显微镜,我们可以观察肌肉和脑组织中的转录,此外,我们的波动分析可以告诉我们在任何给定时间有多少聚合酶参与基因。我们收集的数据将使我们能够确定β-肌动蛋白转录的起始、延伸和终止速率 在组织内的每个细胞中。通过我们的方法设计的方法将具有广泛的应用,并作为一种新的策略,在量化组织中的基因表达水平,更重要的是,推导出一个模型的基因表达一般,这将是理解基因是如何在不同的组织中进行调节的基础,在同一组织内的细胞之间。在真实的时间内研究单个基因的动力学将导致实验直接测试关于细胞分化和稳态期间基因活性的随机性质的假设,以及导出研究疾病基因的方法。

项目成果

期刊论文数量(0)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)

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