Open chromatin and transcriptional regulation of dermal myofibroblasts in SSc

系统性硬化症（SSc）死亡的主要原因是纤维化并发症，间质性肺 疾病（ILD），但皮肤纤维化是导致毁容、疼痛和瘙痒的发病率的主要原因 皮肤和关节挛缩肌成纤维细胞作为主要促纤维化细胞的出现和扩增 是SSc皮肤和ILD发病机制的基础。 虽然对肌成纤维细胞了解很多， 在体外和小鼠纤维化模型中，细胞来源和分子信号驱动 SSc中肌成纤维细胞分化仍不清楚。 我们最近发现了SSc皮肤 肌成纤维细胞、表达SFRP 2-β的肌成纤维细胞祖细胞和相关的改变的转录组 通过单细胞RNA测序（scRNA-测序）。 为了了解潜在的驱动因素， 肌成纤维细胞分化，我们将研究基因的表观遗传和转录控制 在SSc皮肤肌成纤维细胞中调节。我们使用SCENIC分析了scRNA-测序转录组数据， 一种用于检测转录因子（TF）相关调节的计算方法 网络（regulons）。 在SSc肌成纤维细胞的scRNA-测序分析中，我们看到上调的调节子， 与TF相关的基因：FOXP 1、NPDC 1、IRF 7、ZEB 1、HSF 1和FOSL 2。 在R61阶段的第一个目标中 我们将测试预测的TF在真皮成纤维细胞中调节肌成纤维细胞转录组的作用。 来自SSc和健康皮肤活检的原代成纤维细胞培养物将用dCas 9-CRISPRa或CRISPRa转染。 靶向FOXP 1、NPDC 1、IRF 7、ZEB 1、HSF 1或FOSL 2的dCas 9-CRISPRi和单向导RNA（sgRNA），或 SMAD 2或SMAD 3作为典型TGFβ调节途径的阳性对照。 细胞将被 通过scRNA-PCR-seq分析，制备cDNA文库，测序，并分析基因突变 表达式（PERTURB-Seq）。 将TF-干扰细胞的基因表达与未干扰细胞的基因表达进行比较。 具有相同SFRP 2+成纤维细胞表型的细胞。 最近的技术进步也提供了 转座酶可降解染色质单细胞测序法（scATAC-测序） 允许评估反映TF与DNA结合的区域的DNA中的表观遗传变化。 在 R61期的第二个目的是，我们将分析来自健康人皮肤活检组织的细胞中的开放染色质。 和SSc患者。 将鉴定肌成纤维细胞中的开放染色质峰， 与肌成纤维细胞祖细胞中的开放染色质相比，表达SFRP 2-β的成纤维细胞。我们将专注于 分析基因的染色质重塑，如SFRP 4和WIF 1，这些基因显示SSc改变了表达 肌成纤维细胞 我们将把预测的开放染色质中的TF结合位点与TF调节相关联， 目的1中鉴定的肌成纤维细胞相关基因。 在R33阶段，我们将在 R61期，通过过表达TF显示调节肌成纤维细胞基因，单独或组合，和 分析对染色质重塑和肌成纤维细胞分化的影响。

The leading cause of death in systemic sclerosis (SSc) is the fibrotic complication, interstitial lung  disease  (ILD),  but  skin  fibrosis  is  a  leading  cause  for  morbidity  resulting  in  disfiguring,  painful  and  itchy  skin, and joint contractures. The emergence and expansion of myofibroblasts as the main profibrotic cell  underlies  the  pathogenesis  of  both  SSc  skin  and  ILD.  Although  much  is  understood  about  myofibroblast  biology  in  vitro  and  in  murine  models  of  fibrosis,  the  cell  source  and  molecular  signals  driving  myofibroblast  differentiation  in  SSc  remain  obscure.  We  have  recently  identified  SSc  dermal  myofibroblasts,  SFRP2-­‐expressing  myofibroblast  progenitors  and  the  associated  altered  transcriptome  by  single  cell  RNA-­‐sequencing  (scRNA-­‐seq).  In  order  to  understand  the  underlying  drivers  of  myofibroblast  differentiation  we  will  examine  the  epigenetic  and  transcriptional  control  of  genes  regulated in SSc skin myofibroblasts. We have analyzed our scRNA-­‐seq transcriptome data using SCENIC,  a  computational  method  developed  for  detecting  transcription  factor  (TF)-­‐associated  regulatory  networks  (regulons).  In  scRNA-­‐seq  analysis  of  SSc  myofibroblasts,  we  saw  upregulated  regulons  associated  with  the  TFs:  FOXP1,  NPDC1,  IRF7,  ZEB1,  HSF1  and  FOSL2.  In  the  first  aim  of  the  R61  phase  we  will  test  the  role  of  predicted  TFs  in  regulating  myofibroblast  transcriptome  in  dermal  fibroblasts.  Primary fibroblast cultures from SSc and healthy skin biopsies will be transfected with dCas9-­‐CRISPRa or  dCas9-­‐CRISPRi and single guide RNAs (sgRNAs) targeting FOXP1, NPDC1, IRF7, ZEB1, HSF1 or FOSL2, or  SMAD2  or  SMAD3  as  positive  controls  for  the  canonical  TGFβ  regulated  pathway.  Cells  will  then  be  analyzed  by  scRNA-­‐seq,  cDNA  libraries  prepared,  sequenced,  and  analyzed  for  alterations  in  gene  expression  (PERTURB-­‐seq).  Gene  expression  by  TF-­‐perturbed  cells  will  be  compared  to  unperturbed  cells  of  the  same  SFRP2+  fibroblast  phenotype.  Recent  technological  advances  have  also  provided  methodology  for  single  cell  Assay  for  Transposase  Accessible  Chromatin  by  Sequencing  (scATAC-­‐seq)  permitting  assessment  of  epigenetic  changes  in  DNA  that  reflect  regions  of  TF  binding  to  DNA.  In  the  second  aim  of  the  R61  phase  we  will  analyze  open  chromatin  in  cells  from  skin  biopsies  from  healthy  and  SSc  patients  by  scATAC-­‐seq.  Peaks  of  open  chromatin  in  myofibroblasts  will  be  identified  and  compared to open chromatin in myofibroblast progenitor, SFRP2-­‐expressing fibroblasts. We will focus on  analyzing  chromatin  remodeling  of  genes,  such  as  SFRP4  and  WIF1  that  show  altered  expression  by  SSc  myofibroblasts.  We  will  correlate  predicted  TF  binding  sites  in  open  chromatin  with  TF  regulation  of  myofibroblast  associated  genes  identified  in  aim  1.    In  the  R33  phase  we  will  confirm  the  results  in  the  R61  phase  by  overexpressing  TFs  shown  to  regulate  myofibroblast  genes,  singly  or  in  combination,  and  analyzing the effects on chromatin remodeling, and on myofibroblast differentiation.