Open chromatin and transcriptional regulation of dermal myofibroblasts in SSc

点击翻译按钮获取中文摘要

The leading cause of death in systemic sclerosis (SSc) is the fibrotic complication, interstitial lung  disease  (ILD),  but  skin  fibrosis  is  a  leading  cause  for  morbidity  resulting  in  disfiguring,  painful  and  itchy  skin, and joint contractures. The emergence and expansion of myofibroblasts as the main profibrotic cell  underlies  the  pathogenesis  of  both  SSc  skin  and  ILD.  Although  much  is  understood  about  myofibroblast  biology  in  vitro  and  in  murine  models  of  fibrosis,  the  cell  source  and  molecular  signals  driving  myofibroblast  differentiation  in  SSc  remain  obscure.  We  have  recently  identified  SSc  dermal  myofibroblasts,  SFRP2-­‐expressing  myofibroblast  progenitors  and  the  associated  altered  transcriptome  by  single  cell  RNA-­‐sequencing  (scRNA-­‐seq).  In  order  to  understand  the  underlying  drivers  of  myofibroblast  differentiation  we  will  examine  the  epigenetic  and  transcriptional  control  of  genes  regulated in SSc skin myofibroblasts. We have analyzed our scRNA-­‐seq transcriptome data using SCENIC,  a  computational  method  developed  for  detecting  transcription  factor  (TF)-­‐associated  regulatory  networks  (regulons).  In  scRNA-­‐seq  analysis  of  SSc  myofibroblasts,  we  saw  upregulated  regulons  associated  with  the  TFs:  FOXP1,  NPDC1,  IRF7,  ZEB1,  HSF1  and  FOSL2.  In  the  first  aim  of  the  R61  phase  we  will  test  the  role  of  predicted  TFs  in  regulating  myofibroblast  transcriptome  in  dermal  fibroblasts.  Primary fibroblast cultures from SSc and healthy skin biopsies will be transfected with dCas9-­‐CRISPRa or  dCas9-­‐CRISPRi and single guide RNAs (sgRNAs) targeting FOXP1, NPDC1, IRF7, ZEB1, HSF1 or FOSL2, or  SMAD2  or  SMAD3  as  positive  controls  for  the  canonical  TGFβ  regulated  pathway.  Cells  will  then  be  analyzed  by  scRNA-­‐seq,  cDNA  libraries  prepared,  sequenced,  and  analyzed  for  alterations  in  gene  expression  (PERTURB-­‐seq).  Gene  expression  by  TF-­‐perturbed  cells  will  be  compared  to  unperturbed  cells  of  the  same  SFRP2+  fibroblast  phenotype.  Recent  technological  advances  have  also  provided  methodology  for  single  cell  Assay  for  Transposase  Accessible  Chromatin  by  Sequencing  (scATAC-­‐seq)  permitting  assessment  of  epigenetic  changes  in  DNA  that  reflect  regions  of  TF  binding  to  DNA.  In  the  second  aim  of  the  R61  phase  we  will  analyze  open  chromatin  in  cells  from  skin  biopsies  from  healthy  and  SSc  patients  by  scATAC-­‐seq.  Peaks  of  open  chromatin  in  myofibroblasts  will  be  identified  and  compared to open chromatin in myofibroblast progenitor, SFRP2-­‐expressing fibroblasts. We will focus on  analyzing  chromatin  remodeling  of  genes,  such  as  SFRP4  and  WIF1  that  show  altered  expression  by  SSc  myofibroblasts.  We  will  correlate  predicted  TF  binding  sites  in  open  chromatin  with  TF  regulation  of  myofibroblast  associated  genes  identified  in  aim  1.    In  the  R33  phase  we  will  confirm  the  results  in  the  R61  phase  by  overexpressing  TFs  shown  to  regulate  myofibroblast  genes,  singly  or  in  combination,  and  analyzing the effects on chromatin remodeling, and on myofibroblast differentiation.