The exocyst in ureter development and congenital obstructions

项目摘要 先天性梗阻性肾病（CON）是慢性肾脏疾病的最常见原因， 儿童期肾脏疾病，是由于胎儿发育期间尿路梗阻引起的。 的 最常见的CON形式是肾盂输尿管连接部梗阻（UPJO），当阻塞发生在 肾盂与输尿管相连 尽管医疗负担很高，但我们对 UPJO的分子和遗传原因，很少有非手术动物模型。 使用体外细胞模型， 我们已经证明了八肽蛋白外囊运输复合物对于上皮细胞的机制是重要的。 形态发生 为了促进哺乳动物发育过程中外囊的体内研究，我们 利用Cre-10 lox转基因技术构建了一种新型的外囊亚基Sec 10条件性敲除小鼠 技术. 使用我们的floxed-β Sec 10（Sec 10 FL）在输尿管芽周衍生上皮中靶向缺失Sec 10 和Ksp-12 Cre小鼠品系，在子宫内引起双侧UPJO，伴有肾积水，完全无尿， 新生儿致死率 初步研究显示Sec 10 FL/FL;; Ksp-Cre敲除输尿管尿路上皮未能 区分妊娠第16.5天（E16.5）和E17.5之间的浅表层。 这导致了尿路上皮细胞 死亡和对尿液的尿路上皮屏障渗漏，TGF β 1表达和间充质细胞增加， 增殖 到E18.5，由于基质重塑和过度生长，UPJ处的输尿管腔闭塞 成纤维细胞 基于这些发现，我们假设外囊运输是建立 胚胎输尿管中的功能性尿路上皮，尿路上皮屏障的失效激活了致病性伤口 快速闭塞输尿管腔的愈合反应。 我们将通过以下方式来验证这一假设 目的：（1）了解外囊膜依赖性膜运输缺陷如何导致细胞外膜转运受阻， 尿路上皮分化和细胞死亡。 我们的初步数据显示，E-钙粘蛋白不能运输到细胞 E16.5 Sec 10 FL/FL中的连接; E16.5 Sec 10 FL/FL中的连接; E16.5 Sec 10 FL/FL中的连接; E16.5 Sec 10 FL/FL中的连接。 在这里，我们将确定Sec 10删除是否会导致 破坏其他关键细胞-上皮细胞连接蛋白的运输，以及这如何扰乱尿路上皮细胞的机制。 屏障的形成和分层的动力学。 我们还将检测是否在胚胎中缺失E-钙粘蛋白， 输尿管足以概括UPJO表型。 (2)确定致病机制， 间充质扩张导致Sec 10 FL/FL中的UPJO; UPKsp-UPKCre输尿管。 我们会检测尿路上皮细胞 输尿管发育关键阶段的细胞死亡足以引起UPJO表型。 我们将利用 新的离体输尿管移植模型，以测试尿液是否有助于致病性纤维增生反应。 最后，我们将在体内阻断TGF β 1-β SMAD 2/3信号传导，以确定我们是否可以改善UPJO表型。 在Sec 10 FL/FL; BKsp-BKCre小鼠中。 这项建议的预期结果是确定分子机制 在这个小鼠模型中引起产前UPJO，这将对我们理解人类 输尿管发育和CON，并将为开发新的治疗方法奠定基础。

PROJECT SUMMARY    Congenital  obstructive  nephropathy  (CON),  the  most  common  cause  of  chronic  kidney  disease  and  end  stage  renal  disease  in  children,  is  caused  by  obstruction  of  the  urinary  tract  during  fetal  development.    The  most common form of CON is ureteropelvic junction obstruction (UPJO), when the blockage occurs where the  renal  pelvis  connects  to  the  ureter.    Despite  the  high  medical  burden,  we  have  a  poor  understanding  of  the  molecular and genetic causes of UPJOs, with very few non-­surgical animal models.  Using in vitro cell models,  we  have  shown  the  eight-­protein  exocyst  trafficking  complex  to  be  important  for  mechanisms  of  epithelial  morphogenesis.    To  facilitate  in  vivo  studies  of  the  exocyst  during  mammalian  development,  we  have  generated  a  novel  conditional  knockout  mouse  for  the  exocyst  subunit  Sec10  using  Cre-­lox  transgenic  technology.    Targeted  deletion  of  Sec10  in  ureteric  bud-­derived  epithelia,  using  our  floxed-­Sec10  (Sec10FL)  and  the  Ksp-­Cre  mouse  strains,  caused  in  utero  bilateral  UPJOs  with  hydronephrosis,  complete  anuria,  and  neonatal  lethality.    Preliminary  studies  revealed  Sec10FL/FL;;Ksp-­Cre  knockout  ureter  urothelium  failed  to  differentiate  a  superficial  layer  between  gestational  day  16.5  (E16.5)  and  E17.5.    This  led  to  urothelial  cell  death and a leaky urothelial barrier against urine, with an increase in TGFb1 expression and mesenchymal cell  proliferation.  By E18.5, the ureter lumen at the UPJ was obliterated due to stromal remodeling and overgrowth  of fibroblastic cells.  Based on these findings, we hypothesize that exocyst trafficking is necessary to establish  a functional urothelium in embryonic ureters, and failure of the urothelial barrier activates a pathogenic wound  healing  response  that  rapidly  occludes  the  ureter  lumen.    We  will  test  this  hypothesis  through  the  following  Aims:  (1)  Understand  how  defects  in  exocyst-­dependent  membrane  trafficking  lead  to  arrested  urothelial  differentiation  and  cell  death.    Our  preliminary  data  show  E-­cadherin  fails  to  traffic  to  cell-­cell  junctions  in  the  E16.5  Sec10FL/FL;;Ksp-­Cre  urothelial  cells.    Here,  we  will  determine  if  Sec10  deletion  causes  disrupted  trafficking  of  other  key  cell-­cell  junction  proteins  and  how  this  perturbs  the  mechanism  of  urothelial  barrier formation and the dynamics of stratification.  We will also test if deletion of E-­cadherin in the embryonic  ureter is sufficient to recapitulate the UPJO phenotype.  (2) Identify the pathogenic mechanism driving the  mesenchymal  expansion  responsible  for  UPJOs  in  Sec10FL/FL;;Ksp-­Cre  ureters.    We  will  test  if  urothelial  cell death at critical stages of ureter development is sufficient to cause the UPJO phenotype.  We will utilize a  novel  ex  vivo  ureter  explant  model  to  test  if  urine  contributes  to  the  pathogenic  fibroproliferative  response.   Finally, we will block TGFb1-­SMAD2/3 signaling in vivo to determine if we can ameliorate the UPJO phenotype  in Sec10FL/FL;;Ksp-­Cre mice.  The anticipated outcome of this proposal is identifying the molecular mechanisms  that cause prenatal UPJO in this mouse model, which will have a high impact on our understanding of human  ureter development and CON, and will lay the groundwork for development of novel therapies.