Probes for Luminescence-based Superresolution Microscopy

这项研究的目标是为活细胞产生基因编码的生物发光标签。 基于发光的光激活定位显微术（L-SPALM）。这种革命性的 超分辨率成像将保持荧光PALM（fPALM）的所有优点，但将消除荧光PALM的缺点。 需要激发光。fPALM在很大程度上不适用于活细胞成像，因为它需要高激发 导致光毒性的强度。因为发光产生光而不需要外部 激励时，L-EMPALM将不会受到这种限制。最新一代的基因编码 生物发光标记物非常适合于亚细胞结构的宽视野显微镜，但仍然 对于在实际时间尺度上用于单分子定位来说，其太暗了大约1000- 1000倍。补救 针对这一不足，本研究旨在生产具有光子输出率的生物发光探针 足以在一分钟内定位约10万个分子。为了提高产量， 首先耦合到我们最亮的荧光蛋白，以最大限度地提高发光量子产率通过福斯特 共振能量转移机制。一旦第一步达到最大输出，荧光素酶 然后，聚变的一部分将受到结构导向的定向进化，目标是降低 荧光素结合亲和力，从而增加酶的催化速率。这种变化预计 以降低荧光素酶的发光量子产率，但是能量转移到荧光蛋白将 拯救发光，允许更快的酶用这种策略进行工程改造。可用于 活细胞L-PALM，生物发光探针也必须能够可控地开关， 防止每个图像帧中的单个分子之间的信号重叠。两个独立的机制， 产生可切换的光输出将在这个项目中追求：（1）优化之间的能量传递 转肽酶和光开关荧光蛋白，随后是定向进化以增加光输出 并改善转换动力学;（2）将光调制的结构域插入到分裂酶中， 变构控制酶活性。在整个项目中，重点将放在基于Rosetta的 用于产生新荧光素酶-荧光素酶荧光蛋白融合拓扑结构的结构导向计算设计， 改变荧光素酶活性位点环境，以及工程化变构-β-内酰胺酶调节的β-内酰胺酶。引导 基于图像处理的筛选进化将成为改进探针性能的主要途径 在每一个目标的发展。这个项目的最终产品将是一套基因编码的 具有亮度和光开关特性的生物发光探针适合L-β的开发 PALM方法。除了它们用于L-PALM成像的最终效用之外， 该项目的过程将是最明亮和最高性能的生物发光标签尚未开发， 这将在许多其它活细胞和整个生物体成像应用中非常有用。

The goal of the proposed research is to generate genetically encoded bioluminescent tags for live-­cell  luminescence-­based photoactivated localization microscopy (L-­PALM). This revolutionary mode of  superresolution imaging will maintain all of the benefits of fluorescence PALM (fPALM) but will eliminate the  need for excitation light. fPALM is largely unsuitable for imaging live cells because it requires high excitation  intensities that lead to phototoxicity. Because luminescence generates light without the need for external  excitation, L-­PALM will not suffer from this limitation. The latest generation of genetically encoded  bioluminescent labels are well suited for widefield microscopy of subcellular structures, but are still  approximately 1000-­fold too dim to be used for single-­molecule localization on practical time scales. To remedy  this deficiency, this study is designed to produce bioluminescent probes with photon output rates  sufficient to localize ~100,000 molecules in one minute. To generate this increased output, luciferases will  first be coupled to our brightest fluorescent proteins to maximize luminescence quantum yield via the Förster  resonance energy transfer mechanism. Once maximal output is achieved in this first step, the luciferase  portion of the fusion will then be subjected to structure-­guided directed evolution targeted at lowering  oxyluciferin binding affinity and thus increasing the catalytic rate of the enzyme. Such alterations are predicted  to reduce the luminescence quantum yield of the luciferase, but energy transfer to a fluorescent protein will  rescue the luminescence, allowing much faster enzymes to be engineered with this strategy. To be useful for  live-­cell L-­PALM, bioluminescent probes must also be capable of switching on and off controllably to  prevent signal overlap between individual molecules in each image frame. Two independent mechanisms for  producing switchable light output will be pursued in this project: (1) optimization of energy transfer between  luciferases and photoswitchable fluorescent proteins, followed by directed evolution to increase light output  and improve switching kinetics;; (2) insertion of light-­modulated domains into split luciferases in order to  allosterically control enzyme activity. Throughout the project, heavy emphasis will be placed on Rosetta-­based  structure-­guided computational design for generating novel luciferase-­fluorescent protein fusion topologies,  altering luciferase active site environments, and engineering allosterically-­regulated luciferases. Directed  evolution with image-­based screening will then be the primary approach for improving the properties of probes  under development in each aim. The end products of this project will be a set of genetically encoded  bioluminescent probes with brightness and photoswitching properties suitable for the development of L-­ PALM methodologies. Beyond their ultimate utility for L-­PALM imaging, many of the probes created in the  course of this project will be the brightest and highest-­performing bioluminescent tags yet developed, and as  such will highly useful in numerous other live-­cell and whole-­organism imaging applications.