Probes for Luminescence-based Superresolution Microscopy

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The goal of the proposed research is to generate genetically encoded bioluminescent tags for live-­cell  luminescence-­based photoactivated localization microscopy (L-­PALM). This revolutionary mode of  superresolution imaging will maintain all of the benefits of fluorescence PALM (fPALM) but will eliminate the  need for excitation light. fPALM is largely unsuitable for imaging live cells because it requires high excitation  intensities that lead to phototoxicity. Because luminescence generates light without the need for external  excitation, L-­PALM will not suffer from this limitation. The latest generation of genetically encoded  bioluminescent labels are well suited for widefield microscopy of subcellular structures, but are still  approximately 1000-­fold too dim to be used for single-­molecule localization on practical time scales. To remedy  this deficiency, this study is designed to produce bioluminescent probes with photon output rates  sufficient to localize ~100,000 molecules in one minute. To generate this increased output, luciferases will  first be coupled to our brightest fluorescent proteins to maximize luminescence quantum yield via the Förster  resonance energy transfer mechanism. Once maximal output is achieved in this first step, the luciferase  portion of the fusion will then be subjected to structure-­guided directed evolution targeted at lowering  oxyluciferin binding affinity and thus increasing the catalytic rate of the enzyme. Such alterations are predicted  to reduce the luminescence quantum yield of the luciferase, but energy transfer to a fluorescent protein will  rescue the luminescence, allowing much faster enzymes to be engineered with this strategy. To be useful for  live-­cell L-­PALM, bioluminescent probes must also be capable of switching on and off controllably to  prevent signal overlap between individual molecules in each image frame. Two independent mechanisms for  producing switchable light output will be pursued in this project: (1) optimization of energy transfer between  luciferases and photoswitchable fluorescent proteins, followed by directed evolution to increase light output  and improve switching kinetics;; (2) insertion of light-­modulated domains into split luciferases in order to  allosterically control enzyme activity. Throughout the project, heavy emphasis will be placed on Rosetta-­based  structure-­guided computational design for generating novel luciferase-­fluorescent protein fusion topologies,  altering luciferase active site environments, and engineering allosterically-­regulated luciferases. Directed  evolution with image-­based screening will then be the primary approach for improving the properties of probes  under development in each aim. The end products of this project will be a set of genetically encoded  bioluminescent probes with brightness and photoswitching properties suitable for the development of L-­ PALM methodologies. Beyond their ultimate utility for L-­PALM imaging, many of the probes created in the  course of this project will be the brightest and highest-­performing bioluminescent tags yet developed, and as  such will highly useful in numerous other live-­cell and whole-­organism imaging applications.