Biochemical and Cellular Analysis of Redox Modification on Protein Kinase Substrate Selection

项目摘要 活性氧（Reactive oxygen species，ROS）是许多信号通路中的重要第二信使 与健康和疾病有关。虽然在理解这些机制方面取得了很大进展， ROS水平在细胞内受到调节，但对细胞内发生的分子信号事件知之甚少。 ROS生成的下游。越来越多的证据表明，蛋白激酶直接 由ROS修饰调节。例如，在氧化还原酶中特定的Cys残基的可逆氧化， 敏感激酶已被证明影响其活性（积极或消极），亚细胞 定位和蛋白质-蛋白质相互作用。在许多情况下，受影响的激酶中的修饰的Cys是 在同一激酶家族的其他成员中是保守的。这就提出了可逆氧化 可能是调节细胞内激酶功能的一般手段。为了进一步探索这种可能性，我们 最近使用功能蛋白微阵列来研究氧化对全球底物的影响， 选择一系列AGC和CMCG激酶家族成员。这些研究表明，H2 O2-依赖性 氧化改变了许多激酶的底物偏好，导致氧化的激酶中不同的底物分布。 减少国家。有趣的是，在大多数情况下，底物磷酸化的增加和减少 观察了因此，可逆氧化可能在控制信号传导中起重要作用 细胞中氧化还原敏感激酶的特异性。为了进一步研究这些问题，我们建议1）检查 H2 O2-过氧化氢诱导的激酶底物选择变化的分子机制（目的1和2）， 2)开始探索氧化还原修饰对激酶依赖性信号传导的功能影响 细胞内的过程（目标3）。在这些研究中，我们将重点关注两个具有代表性的AGC和CMGC 家族成员，即PKA和ERK 2。这不仅将提供新的见解氧化还原调节 这些重要的激酶，但它也将为其他氧化还原敏感激酶的分析奠定基础 在微阵列实验中发现的。总之，这些研究将提供独特的见解，ROS介导的 调节激酶功能，并为未来研究ROS-β和 在生理和病理状态下，磷酸化依赖的信号通路。

PROJECT SUMMARY    Reactive oxygen species (ROS) are emerging as critical second messengers in many signaling pathways  related to health and disease. While much progress has been made in understanding the mechanisms by  which ROS levels are regulated inside cells, less is known about the molecular signaling events that occur  downstream of ROS generation. A growing body of evidence suggests that protein kinases are directly  regulated by ROS modification. For instance, the reversible oxidation of specific Cys residues in redox-­ sensitive kinases has been shown to influence their activity (either positively or negatively), subcellular  localization, and protein-­protein interactions. In many cases, the modified Cys in the affected kinase is  conserved among other members in the same kinase family. This raises the possibility that reversible oxidation  may be a general means of regulating kinase function inside cells. To explore this possibility further, we  recently used functional protein microarrays to examine the impact of oxidation on the global substrate  selection of a series of AGC and CMCG kinase family members. These studies suggest that H2O2-­dependent  oxidation shifts the substrate preference of many kinases, leading to distinct substrate profiles in the oxidized  and reduced states. Interestingly, in most cases, both increases and decreases in substrate phosphorylation  were observed. As a consequence, reversible oxidation may play an important role in controlling the signaling  specificity of redox-­sensitive kinases in cells. To investigate these questions further, we propose 1) to examine  the molecular mechanisms underlying the H2O2-­induced shifts in kinase substrate selection (Aims 1 & 2) and  2) to begin to explore the functional consequences of redox modification on kinase-­dependent signaling  processes inside the cell (Aim 3). During these studies, we will focus on two representative AGC and CMGC  family members, namely PKA and ERK2. Not only will this provide new insights into the redox regulation of  these important kinases, but it will also lay a foundation for the analysis of other redox sensitive kinases  identified in the microarray experiments. Together, these studies will offer unique insights into ROS-­mediated  regulation of kinase function and provide the foundation for future studies into crosstalk between ROS-­ and  phosphorylation-­dependent signaling pathways in physiological and pathological states.