Biochemical and Cellular Analysis of Redox Modification on Protein Kinase Substrate Selection

项目总结： -- 活性氧自由基(ROS)正在成为许多信号转导途径中的关键第二信使。 与人类健康和疾病有关。虽然取得了很大进展，但在对人类健康和疾病机制的理解方面仍未取得进展。 在细胞内，哪些ROS水平受到广泛的调控，但对于可能发生的事件的信号转导机制，人们知之甚少。 Ros下一代的下游基因。越来越多的证据表明，这些蛋白和激酶是直接致病的。 受ROS修饰的调节。例如，在氧化还原过程中发现特定的Cys残基的不可逆氧化反应-- 目前已有研究表明，敏感的丝裂原激酶可能会影响它们的神经活动能力(无论是积极的还是消极的)，尤其是亚细胞的影响。 定位、修复和修复蛋白-蛋白之间的相互作用。在许多情况下，在受影响的蛋白激酶修复过程中，半胱氨酸氨基转移酶基因被修饰。 在同一个蛋白激酶家族中的其他成员中保守基因。这增加了可逆的蛋白氧化的可能性。 这可能是一种普遍的方法，意味着调节细胞内肌酸激酶的功能。我们希望进一步探索这一可能性。 最近，我们使用了一种功能性蛋白质和微阵列，以进一步研究氧化技术对全球最大生物底物的影响。 从一系列的AGC和CMCG激酶家族成员中挑选出一组。这些研究表明，H_2O_2依赖。 氧化作用改变了许多酪氨酸激酶的底物偏好，导致人们在氧化的过程中产生不同的底物谱。 有趣的是，在大多数情况下，它们都增加了底物的磷酸化水平，而降低了底物的磷酸化水平。 没有观察到。因此，可逆的气体氧化可能在控制信号的过程中发挥重要的作用。 细胞中氧化还原敏感蛋白激酶的特异性。为了进一步研究这些问题，我们可以提出1)方法来进一步研究。 这些分子生物学机制是H_2O_2诱导的肌酸激酶和底物选择过程中的蛋白质转移的基础(目标是1和2)。 2)我们将开始努力探索氧化还原和修饰对依赖肌动蛋白的信号转导的主要功能和后果。 过程是在细胞内部进行的(AIM-3)。在这些研究中，我们将重点关注两个最具代表性的组织--AGC和CMGC。 家庭成员，即PKA和ERK2。不仅如此，这将为我们对银行的新的氧化还原和监管机制提供新的见解。 这些都是重要的氧化还原酶，但它也将为进一步分析其他氧化还原敏感的酶奠定基础。 在新的微阵列实验中发现了这些信息。这些研究加在一起，将为研究ROS介导的基因提供独特的信息洞察力。 对肌动蛋白功能的调控为今后进一步研究Ros和之间的串扰提供了重要的基础。 依赖于磷酸化的信号转导通路在生理和病理状态下都存在。

PROJECT SUMMARY    Reactive oxygen species (ROS) are emerging as critical second messengers in many signaling pathways  related to health and disease. While much progress has been made in understanding the mechanisms by  which ROS levels are regulated inside cells, less is known about the molecular signaling events that occur  downstream of ROS generation. A growing body of evidence suggests that protein kinases are directly  regulated by ROS modification. For instance, the reversible oxidation of specific Cys residues in redox-­ sensitive kinases has been shown to influence their activity (either positively or negatively), subcellular  localization, and protein-­protein interactions. In many cases, the modified Cys in the affected kinase is  conserved among other members in the same kinase family. This raises the possibility that reversible oxidation  may be a general means of regulating kinase function inside cells. To explore this possibility further, we  recently used functional protein microarrays to examine the impact of oxidation on the global substrate  selection of a series of AGC and CMCG kinase family members. These studies suggest that H2O2-­dependent  oxidation shifts the substrate preference of many kinases, leading to distinct substrate profiles in the oxidized  and reduced states. Interestingly, in most cases, both increases and decreases in substrate phosphorylation  were observed. As a consequence, reversible oxidation may play an important role in controlling the signaling  specificity of redox-­sensitive kinases in cells. To investigate these questions further, we propose 1) to examine  the molecular mechanisms underlying the H2O2-­induced shifts in kinase substrate selection (Aims 1 & 2) and  2) to begin to explore the functional consequences of redox modification on kinase-­dependent signaling  processes inside the cell (Aim 3). During these studies, we will focus on two representative AGC and CMGC  family members, namely PKA and ERK2. Not only will this provide new insights into the redox regulation of  these important kinases, but it will also lay a foundation for the analysis of other redox sensitive kinases  identified in the microarray experiments. Together, these studies will offer unique insights into ROS-­mediated  regulation of kinase function and provide the foundation for future studies into crosstalk between ROS-­ and  phosphorylation-­dependent signaling pathways in physiological and pathological states.