Structural and Functional Characterization of the McrBC Restriction System

点击翻译按钮获取中文摘要

Abstract     Modification-­dependent  restriction  systems  (MDRs)  recognize  and  cleave  modified  foreign  DNA.  These  proteins  are  thought  to  play  a  role  in  establishing  the  epigenetic  landscape  of  bacterial  genomes  and  are  especially  important  in  protecting  against  predatory  bacteriophage  viruses,  many  of  which  incorporate  modified bases into their DNA to evade detection by other defense systems. While MDRs can be found in  most antibiotic-­resistant bacteria including methicillin-­resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Clostridium  difficile, and carbapenem-­resistant enterobacteriaceae like Klebsiella pneumoniae, no eukaryotic homologs  exist, making them promising targets for drug design. Inhibiting these systems has the potential to enhance  the  efficacy  of  phage-­mediated  bacterial  killing,  thus  providing  new  therapeutic  strategies  to  combat  persistent,  antibiotic  resistant  microbial  infections.  It  is  our  long-­term  goal  to  study  the  basic  biology  and  mechanisms of MDRs and use this knowledge to improve current phage therapy approaches. This proposal  examines  the  structure  and  function  of  the  McrBC  restriction  system,  a  two-­component  MDR  that  targets  DNA  containing  methylated  cytosines.  E.  coli  McrB  contains  an  N-­terminal  DNA  binding  domain  and  a  C-­ terminal  AAA+  motor  domain  that  hydrolyzes  GTP  and  mediates  nucleotide-­dependent  oligomerization.  McrB’s basal GTPase activity is stimulated via interaction with its partner endonuclease McrC. Biochemical  studies  suggest  a  model  for  DNA  cleavage  in  which  McrB  and  McrC  assemble  together  at  two  distant  methylated  sites  and  translocate  in  a  manner  dependent  on  stimulated  GTP  hydrolysis.  Collision  of  these  McrBC  assemblies  triggers  cleavage  of  both  DNA  strands.  Despite  this  model,  the  molecular  and  mechanistic details underlying McrBC function remain poorly defined. In Aim 1, we will dissect the species-­ specific  determinants  of  DNA  binding  in  different  McrB  homologs  using  X-­ray  crystallography  and  biochemistry.  We  will  also  generate  chimeras  that  exchange  the  DNA  binding  domains  between  different  McrB  homologs  to  test  the  hypothesis  that  the  core  hydrolysis  and  cleavage  machineries  in  McrBC  are  conserved and have adapted to different evolutionary pressures via a modular design. In Aim 2, we will use  mutagenesis and kinetic assays to identify the critical catalytic components responsible for McrC-­stimulated  GTPase  activity.  In  Aim  3,  we  will  determine  the  structure  and  architectural  organization  of  the  McrBC  restriction  complex  at  atomic  resolution  by  X-­ray  crystallography  and  cryo-­electron  microscopy.  These  efforts will provide new insights into how McrBC complexes bind DNA, assemble, and hydrolyze GTP.