Structural and Functional Characterization of the McrBC Restriction System

摘要： -- 依赖于修饰的DNA限制系统(MDR)可以识别并切割修改后的外来DNA。 人们普遍认为，蛋白质在建立全球细菌基因组的表观遗传图谱方面发挥了重要作用。 尤其是在保护人类免受掠夺性噬菌体病毒侵袭方面的重要作用，其中许多病毒都应该包括在内。 经过修饰的MDR碱基进入它们的DNA序列，以躲避其他国防防御系统的检测。然而，MDR序列无法在计算机中找到。 大多数耐药细菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和梭状芽孢杆菌。 难辨杆菌、耐碳青霉烯类和耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌与肺炎克雷伯菌一样，没有非真核细菌同源物。 存在，使它们成为药物设计的有希望的新靶点。通过抑制这些新系统的存在，使其成为进一步增强的潜在目标。 噬菌体介导的杀菌效果显著，从而为抗击肺炎提供了新的新的治疗策略。 持久、高效的抗生素对微生物感染具有抵抗力。因此，继续研究最基本的生物生物学原理和方法是我们的长期目标。 多药耐药机制的建立和使用将利用这些知识来进一步改进目前的噬菌体疗法和治疗方法。 审查了新的MCRBC碳限制制度的总体结构和功能框架，提出了一个由两个组成部分组成的新MDR计划，该计划的目标是。 含有甲基化的胞嘧啶的DNA。大肠杆菌McrB含有一个N端的DNA结合区域和一个C-端。 末端AAA+是一种运动蛋白结构域，它可以水解人GTP蛋白，并介导核苷酸依赖的寡聚反应。 McrB的基础GTP酶活性是通过与其主要合作伙伴MCRB的核酸内切酶MCRC的相互作用而被激发的。 研究表明，这是一种新的DNA切割模式，在这种模式下，McrB和MCRC可以在至少两个小时的距离内将DNA组装在一起。 甲基化的DNA位点和DNA以一种依赖于刺激的GTP水解酶的方式进行移位。它们之间的碰撞。 McrBC基因组件会触发DNA和DNA两条链的切割。尽管有这种新的模式，但它的分子结构和结构。 McrBC的潜在功能的机械性细节仍未定义得很好。在目标1中，我们将不会解剖这一物种-- 用X射线、结晶学和电子显微镜研究不同McrB同系物中结合DNA的特定决定因素。 生物化学。我们还将产生一些嵌合体，这些嵌合体可以在不同的生物之间交换结合的DNA结构域。 McrB的同系物试图检验这一假说，即McrBC中最核心的水解酶和裂解的机械是。 保守的动物和动物已经适应了不同的进化动物压力，通过一个简单的模块化设计。在我们的目标2中，我们将继续使用它。 诱变试验和动力学分析有助于确定导致MCRC刺激反应的关键催化反应组分。 GTPase是一种活动。在目标3中，我们将无法确定MCRBC的总体结构和结构和组织结构。 通过X射线、结晶学和冷冻电子显微镜对原子分辨率的复杂结构进行限制。 这些努力还将为McrBC基因复合体如何结合DNA、组装、合成和降解GTP提供新的科学见解。

Abstract     Modification-­dependent  restriction  systems  (MDRs)  recognize  and  cleave  modified  foreign  DNA.  These  proteins  are  thought  to  play  a  role  in  establishing  the  epigenetic  landscape  of  bacterial  genomes  and  are  especially  important  in  protecting  against  predatory  bacteriophage  viruses,  many  of  which  incorporate  modified bases into their DNA to evade detection by other defense systems. While MDRs can be found in  most antibiotic-­resistant bacteria including methicillin-­resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Clostridium  difficile, and carbapenem-­resistant enterobacteriaceae like Klebsiella pneumoniae, no eukaryotic homologs  exist, making them promising targets for drug design. Inhibiting these systems has the potential to enhance  the  efficacy  of  phage-­mediated  bacterial  killing,  thus  providing  new  therapeutic  strategies  to  combat  persistent,  antibiotic  resistant  microbial  infections.  It  is  our  long-­term  goal  to  study  the  basic  biology  and  mechanisms of MDRs and use this knowledge to improve current phage therapy approaches. This proposal  examines  the  structure  and  function  of  the  McrBC  restriction  system,  a  two-­component  MDR  that  targets  DNA  containing  methylated  cytosines.  E.  coli  McrB  contains  an  N-­terminal  DNA  binding  domain  and  a  C-­ terminal  AAA+  motor  domain  that  hydrolyzes  GTP  and  mediates  nucleotide-­dependent  oligomerization.  McrB’s basal GTPase activity is stimulated via interaction with its partner endonuclease McrC. Biochemical  studies  suggest  a  model  for  DNA  cleavage  in  which  McrB  and  McrC  assemble  together  at  two  distant  methylated  sites  and  translocate  in  a  manner  dependent  on  stimulated  GTP  hydrolysis.  Collision  of  these  McrBC  assemblies  triggers  cleavage  of  both  DNA  strands.  Despite  this  model,  the  molecular  and  mechanistic details underlying McrBC function remain poorly defined. In Aim 1, we will dissect the species-­ specific  determinants  of  DNA  binding  in  different  McrB  homologs  using  X-­ray  crystallography  and  biochemistry.  We  will  also  generate  chimeras  that  exchange  the  DNA  binding  domains  between  different  McrB  homologs  to  test  the  hypothesis  that  the  core  hydrolysis  and  cleavage  machineries  in  McrBC  are  conserved and have adapted to different evolutionary pressures via a modular design. In Aim 2, we will use  mutagenesis and kinetic assays to identify the critical catalytic components responsible for McrC-­stimulated  GTPase  activity.  In  Aim  3,  we  will  determine  the  structure  and  architectural  organization  of  the  McrBC  restriction  complex  at  atomic  resolution  by  X-­ray  crystallography  and  cryo-­electron  microscopy.  These  efforts will provide new insights into how McrBC complexes bind DNA, assemble, and hydrolyze GTP.