Structural and Functional Characterization of the McrBC Restriction System

摘要 修饰依赖性限制系统（MDR）识别并切割修饰的外源DNA。 这些 蛋白质被认为在建立细菌基因组的表观遗传景观中起作用， 尤其重要的是防止捕食性噬菌体病毒，其中许多包含 修改了DNA中的碱基，以逃避其他防御系统的检测。虽然MDR可以在 大多数抗生素耐药菌，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、梭菌 艰难梭菌和碳青霉烯耐药肠杆菌科，如肺炎克雷伯菌，无真核同源物 存在，使它们成为药物设计的有希望的目标。抑制这些系统有可能增强 噬菌体介导的细菌杀伤的功效，从而提供了新的治疗策略， 持续的抗生素耐药性微生物感染。 我们的长远目标是研究基础生物学， MDRs的机制，并使用这些知识来改善目前的噬菌体治疗方法。这项建议 检查了McrBC限制系统的结构和功能，这是一个双组分MDR， 含有甲基化胞嘧啶的DNA。 E. coliMcrB含有一个N端DNA结合结构域和一个C端DNA结合结构域， 末端AAA+马达结构域，其水解GTP并介导核苷酸依赖性寡聚化。 McrB的基础GT酶活性通过与其伴侣内切核酸酶McrC相互作用而被刺激。生化 研究提出了一种DNA切割模型，其中McrB和McrC在两个距离处组装在一起， 甲基化位点，并以依赖于刺激的GTP水解的方式易位。 这些碰撞 McrBC组装触发两条DNA链的切割。 尽管这种模型，分子和 McrBC功能的机制细节仍然不清楚。在目标1中，我们将剖析物种- 用X射线晶体学研究不同McrB同系物中DNA结合的特异性决定簇， 生物化学 我们还将产生嵌合体，在不同的DNA结合域之间交换DNA结合域。 McrB同源物，以检验McrBC中的核心水解和裂解机制是 通过模块化的设计来保存并适应不同的进化压力。在目标2中，我们将使用 诱变和动力学测定，以确定负责McrC-β刺激的关键催化组分， GT活性。 在目标3中，我们将确定McrBC的结构和体系结构组织 通过X射线晶体学和低温电子显微镜以原子分辨率观察限制复合物。 这些 这些努力将为McrBC复合物如何结合DNA、组装和水解GTP提供新的见解。

Abstract     Modification-­dependent  restriction  systems  (MDRs)  recognize  and  cleave  modified  foreign  DNA.  These  proteins  are  thought  to  play  a  role  in  establishing  the  epigenetic  landscape  of  bacterial  genomes  and  are  especially  important  in  protecting  against  predatory  bacteriophage  viruses,  many  of  which  incorporate  modified bases into their DNA to evade detection by other defense systems. While MDRs can be found in  most antibiotic-­resistant bacteria including methicillin-­resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Clostridium  difficile, and carbapenem-­resistant enterobacteriaceae like Klebsiella pneumoniae, no eukaryotic homologs  exist, making them promising targets for drug design. Inhibiting these systems has the potential to enhance  the  efficacy  of  phage-­mediated  bacterial  killing,  thus  providing  new  therapeutic  strategies  to  combat  persistent,  antibiotic  resistant  microbial  infections.  It  is  our  long-­term  goal  to  study  the  basic  biology  and  mechanisms of MDRs and use this knowledge to improve current phage therapy approaches. This proposal  examines  the  structure  and  function  of  the  McrBC  restriction  system,  a  two-­component  MDR  that  targets  DNA  containing  methylated  cytosines.  E.  coli  McrB  contains  an  N-­terminal  DNA  binding  domain  and  a  C-­ terminal  AAA+  motor  domain  that  hydrolyzes  GTP  and  mediates  nucleotide-­dependent  oligomerization.  McrB’s basal GTPase activity is stimulated via interaction with its partner endonuclease McrC. Biochemical  studies  suggest  a  model  for  DNA  cleavage  in  which  McrB  and  McrC  assemble  together  at  two  distant  methylated  sites  and  translocate  in  a  manner  dependent  on  stimulated  GTP  hydrolysis.  Collision  of  these  McrBC  assemblies  triggers  cleavage  of  both  DNA  strands.  Despite  this  model,  the  molecular  and  mechanistic details underlying McrBC function remain poorly defined. In Aim 1, we will dissect the species-­ specific  determinants  of  DNA  binding  in  different  McrB  homologs  using  X-­ray  crystallography  and  biochemistry.  We  will  also  generate  chimeras  that  exchange  the  DNA  binding  domains  between  different  McrB  homologs  to  test  the  hypothesis  that  the  core  hydrolysis  and  cleavage  machineries  in  McrBC  are  conserved and have adapted to different evolutionary pressures via a modular design. In Aim 2, we will use  mutagenesis and kinetic assays to identify the critical catalytic components responsible for McrC-­stimulated  GTPase  activity.  In  Aim  3,  we  will  determine  the  structure  and  architectural  organization  of  the  McrBC  restriction  complex  at  atomic  resolution  by  X-­ray  crystallography  and  cryo-­electron  microscopy.  These  efforts will provide new insights into how McrBC complexes bind DNA, assemble, and hydrolyze GTP.