FoxO3A介导脂联素调控糖尿病骨细胞凋亡及骨整合作用的机制研究

As the major complication in diabetes, reduced bone mass and poor biomechanical performance are characterized by hyperglycemia-induced excessive oxidative stress and apoptosis of osteocytes. Therefore, targeting apoptosis of osteocytes has become a new arena in the improvement of osseointegration of diabetes. Adiponectin is a protein hormone mainly secreted by adipose tissue, which plays an anti-apoptotic role by decreasing intracellular ROS level, and FoxO3A is the critical downstream transcription factor. In a preliminary research, we found Adiponectin could inhibit apoptosis of osteocytes and reduce osteoclastogenesis induced by high-glucose. Based on the previous results, we hypothesize that Adiponectin acts as a ROS scanvenger to inhibit excessive apoptosis under diabetic environment via FoxO3A modulation, and consequently promote the progress of implant osseointegration. To address the hypothesis, the present study will verify the protect effect of Adiponectin on osteocytes apoptosis and implant osseointegration into the femurs of conditional knockout diabetic mice (Dmp1-Cre+-FoxO3fl/fl) in vivo. Next, we intend to testify the antioxidant effect of Adiponectin on osteocytes apoptosis via primary cell culture and adding Ad-FoxO3, investigating the underlying mechanism of FoxO3A on the role of Adiponectin modulation on osteocyte apoptosis and osseointegration in diabetes. Through this research, it is helpful to deepen the understanding of the molecular mechanism of osseointegration and to provide new ideas for improving the osseointegration of diabetes.

糖尿病环境下细胞氧化应激失调、骨细胞凋亡是骨量减少、骨生物机械性能降低的一项重要原因。因此，寻找一种安全有效的手段来对抗骨细胞凋亡成为促进糖尿病种植体骨结合的新热点。脂联素是脂肪细胞分泌蛋白，可通过降低细胞内ROS产生抗凋亡作用，其中FoxO3A是介导其作用的关键调控因子。申请者前期研究发现，脂联素可减少高糖培养基诱导的骨细胞凋亡，降低破骨细胞形成。因此，我们推测：脂联素可通过调控FoxO3A抑制氧化应激、拮抗骨细胞凋亡，对种植体骨结合具有保护作用。本研究建立骨细胞条件性FoxO3基因敲除小鼠糖尿病股骨种植模型，初步探索脂联素对糖尿病骨细胞凋亡和骨结合的调节作用；并通过原代培养骨细胞，构建Ad-FoxO3，从细胞形态学和功能学深入研究FoxO3A介导脂联素调控糖尿病骨细胞凋亡和骨结合作用的机制。通过此项研究，有助于加深理解糖尿病种植体骨结合的分子机制，为提高糖尿病种植体骨结合提供新的思路。

临床研究表明，糖尿病环境下高血糖持续的氧化应激与骨细胞的凋亡有关。而细胞氧化应激失调、骨细胞凋亡是骨量减少、骨生物机械性能降低的一项重要原因，影响种植体骨结合。脂联素(APN)是脂肪细胞分泌蛋白，可通过降低细胞内活性氧（ROS）产生抗凋亡作用，FoxO3A是介导其作用的关键调控因子。然而，APN与骨细胞凋亡之间的关系尚未完全阐明。本课题旨在探查APN是否可以在高糖环境中通过调节ROS的产生，抗骨细胞凋亡，从而促进糖尿病种植体骨结合。本课题通过体外细胞实验和体内动物实验，分别从细胞形态学和生物功能学研究FoxO3A介导脂联素调控糖尿病骨细胞凋亡和种植体骨结合作用的机制。Hoechst染色和荧光显微镜观察骨细胞MLO-Y4细胞的凋亡；实时定量PCR和WB检测Caspase 3、Caspase 8和Bcl-2的表达；用活性氧试剂盒和荧光显微镜检测ROS的产生。此外，还通过WB检测AMPK/FoxO3A信号通路中蛋白质的表达。结果显示：在高糖环境下，APN促进MLO-Y4骨细胞的增殖和Bcl-2的表达，并抑制Caspase 3、Caspase 8和ROS的表达，这种作用呈现出剂量依赖性方式。APN促进了p-AMPK和p-AMPK/AMPK的激活，在10分钟达到最高水平，并在30分钟恢复到基线水平。p-FoxO3A/FoxO3A在细胞质和细胞核中的表达在15分钟时达到峰值，并在60分钟时恢复到基线。结果提示，APN具有抗凋亡作用并在高糖环境中调节MLO-Y4骨细胞中ROS的产生，AMPK/FoxO3A信号通路可能是参与APN调控糖尿病患者骨细胞凋亡作用的关键信号通路。此外，本课题拟建立小鼠糖尿病颌骨种植模型，进一步探索脂联素对糖尿病骨细胞凋亡和骨结合的调节作用。通过此项课题研究，有助于加深理解糖尿病种植体骨结合的分子机制，为提高糖尿病种植体骨结合提供新的思路。

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