保护剂传质扩散特性对神经干细胞球玻璃化冻存作用机理的研究

针对玻璃化保护剂导入对神经干细胞产生的渗透损伤和毒性损伤，进行了神经干细胞的保护剂导入及冻存实验研究，并在多孔介质模型的基础上建立了保护剂导入神经干细胞球的传质模型。 . 首先以鼠尾I型胶原包埋神经干细胞进行了慢速低温冻存，构建了新的冷冻体系。结果表明胶原包埋的神经干细胞状态良好，胶原体系起到了缓渗的作用，细胞复苏后活率明显高于单纯的细胞悬液的冻存。同时考察了海藻糖的玻璃化能力和将其加入保护剂的效果：海藻糖能够实现玻璃化的最低浓度是55%，通过神经干细胞冻后活率的比较，优选了一种包含海藻糖的多组分保护剂，细胞玻璃化冻存后的复苏率达到71.7%。利用该保护剂进行了低温导入和常温导入，完善神经干细胞冻存复苏后的生化检测，并尝试了长期冻存。结果表明低温导入略优于常温导入，神经球长期冻存后活率检测结果仅为19%，但继续培养可实现一定程度增殖。进而设计了等渗透压差、时间间隔逐渐降低的六步导入方法，并考察了不同尺寸与状态的神经干细胞球的不同浓度DMSO的慢速冻存和玻璃化冻存效果。结果表明采用等渗透压差、平衡时间间隔逐渐减小的分步导入方法可以有效地减轻细胞的渗透性损伤和毒性损伤；神经干细胞间的亲密联系和刻痕信号与直径尺寸共同作用，影响神经干细胞的冻存复苏效果。采用玻璃化法冷冻保存的神经球，其冻后细胞活性以及其在维持球状形态和结构的完整性方面都要显著好于常规慢速冻存法。. 为建立神经干细胞球的冷冻保护剂导入模型，应用渗透压技术考察了冷冻保护剂种类、浓度、细胞密度及导入或洗脱方案等因素对神经干细胞活率的影响。实验表明在导入过程中外部溶液渗透压变化存在最高点，该时间点后渗透压值变化不再剧烈，表明冷冻保护液和神经干细胞之间的渗透过程已经达到了平衡状态，此时间点应停止保护剂的导入。利用显微图像采集分析的方法，测定了神经干细胞渗透不变体积，水的胞膜渗透系数以及DMSO和乙二醇的K-K模型和两参数模型的相关参数。通过刚性球模型和体积可变模型得出了不同条件下细胞内外浓度以及细胞膜两侧浓度差随时间和空间的变化曲线。胞外的保护剂浓度变化较快，在第5s即可接近渗透平衡；而由于跨膜阻力的影响，细胞内的保护剂浓度变化则较为平缓，细胞内外的浓差在5s附近可达到峰值，这对优化冷冻保护剂的导入有重要指导意义。