甲基莲心碱及其代谢物莲心碱和异莲心碱的吸收代谢机理研究

甲基莲心碱（Nef）是莲子心的主要成分，具有抗心率失常、降血压、逆转多药耐药等作用，是一类重要的双苄基异喹啉类生物碱。目前国内外对其吸收代谢的研究尚不够深入。我们采用LC-MS法分析研究了Nef在肝微粒体中的转化产物，表明莲心碱和异莲心碱是其主要代谢产物，但代谢具有种属差异。肠道Caco-2细胞实验表明，Nef及主要代谢产物的吸收具有结构依赖性。因此，本项目拟对Nef及主要代谢物的吸收机制进行研究并确认所涉及的转运蛋白，并利用课题组建立的人源化CYP、UGT、GST转基因细胞体系研究调控Nef生物转化的分子机制，采用报告基因法检测Nef对核受体的激活效应，探明Nef对药酶的的诱导作用机理。Nef及其代谢产物结构中均有酚羟基，易氧化为醌式结构引起肝肾毒性，拟利用巯基化合物谷胱甘肽与氧化产物的结合反应捕获活性代谢物，阐明Nef的代谢增毒及解毒机理。为该类生物碱的合理利用和深入研究奠定理论基础。

甲基莲心碱（Neferine, Nef）和莲心碱、异莲心碱是莲子心生物碱的主要成分，文献报道及前期研究提示莲子心生物碱与ABC转运体可能存在相互作用，本项目利用稳定高表达人源P-糖蛋白（P-gp）的MDCK转基因细胞、经细胞积聚和双向转运实验，在体外模型上首次确证了Nef、莲心碱和异莲心碱均为P-gp的底物，其透膜能力较弱预测体内口服吸收较差；莲心碱在MDCK-MRP2和MDCK的细胞积聚量相似，双向转运实验未表现出显著的方向性，说明其不是MRP2的底物；稳定高表达人BCRP的猪肾小管上皮细胞LLC-PK1细胞实验则表明莲心碱是BCRP的底物。在前期分析Nef在狗肝微粒体中孵育得到转化产物的基础上，分析鉴定了异莲心碱的代谢产物，对Nef在人肝微粒体的主要代谢产物及相关代谢酶进行确证并测定酶动力学参数。通过采用报告基因法初步检测Nef、莲心碱、异莲心碱对PXR/CAR激活效应。结果表明，三者对CYP3A4-PXR和CYP2B6-PXR均有诱导作用，Nef对PXR的诱导作用最强，对CAR均未表现出诱导作用。采用人肝微粒体孵育体系，利用巯基化合物谷胱甘肽捕获得到Nef的4个亚甲基醌类反应性代谢物，经化学抑制剂法和单一重组P450酶法确证参与Nef氧化代谢生成活性中间体的主要代谢酶亚型是CYP3A4。考察人肝脏胞浆中主要的GSTs在形成反应性代谢物中的重要性，预测其突变体不会影响Nef的代谢解毒。为考察Nef反应性代谢物潜在的细胞毒性，在稳定高表达人源CYP3A4的MDCK细胞模型中分别加入GSH的合成阻断剂丁硫氨酸亚砜亚胺（BSO）和氧化清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）进行细胞毒性研究，结果显示BSO增强Nef的细胞毒性，而NAC减弱毒性作用，在HepG2细胞上亦表现相同的趋势，初步验证了Nef的反应性代谢物能增强细胞毒性。综上结果，P-gp在上述生物碱的转运中发挥的作用，CYP3A4和CYP2C8、CYP2D6是Nef在人肝微粒体中代谢的主要亚酶，CYP3A4 是氧化生成亚甲基醌式结构的主要代谢酶。提示Nef作为抗肿瘤有效成分，其机制可能包括生成反应性代谢物消耗还原型谷胱甘肽打破氧化平衡体系引发的细胞凋亡。同时，考虑个体间CYP3A4表达差异，CYP3A4的催化代谢活性多态性或与显著诱导CYP3A4表达的药物联用时Nef的服用剂量需要酌情减量避免肝毒性的发生。

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