重金属促进环境菌群抗生素抗性向病原菌转移的机制研究

The transfer of antibiotic resistance genes (ARGs) from the environmental microbes to human pathogens still need to be studied, and is among the critical knowledge gaps of ARGs health risks. Heavy metals widely distributed in the environment and posed selection pressure on ARGs and also impacted the horizontal transfer of ARGs. This project concerned on the role of heavy metals during the horizontal gene transfer of ARGs from environmental microbes to pathogens and related mechanism, 1) experiments will be designed to simulate gene transfer from environmental microbes to pathogen with the impact of heavy metals. The ARGs transfer frequencies will be evaluated with the change of transconjugant counts, 2) based on the designed methods, the impact of speciation, concentrations and types of heavy metals on ARGs horizontal transfer will be investigated, 3) how antibiotics influence the previous processes will be identified. We aim to deeply understand the role of heavy metals in ARGs dissemination, which could help to identify the health risk of ARGs spread.

环境中抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes，ARGs）如何转移至人体致病菌，是亟待解答抗生素抗性基因健康风险的关键问题之一。重金属在环境中广泛存在，对环境中ARGs具有重要的选择性作用并影响ARGs水平迁移。本项目在前期工作的基础上，重点围绕重金属对ARGs在微生物之间发生基因水平转移时的作用及其内在机理等科学问题开展研究：（1）建立ARGs在重金属作用下由复杂的环境微生物群落向环境细菌及人体致病菌发生基因水平转移的实验方法，并通过筛选转化接合子的方法来推断抗生素抗性传递发生的频率；（2）基于所建立的方法，考察并研究重金属形态、浓度和种类对ARGs水平转移的影响规律及机理；（3）考察有抗生素共同作用时，重金属对ARGs转移的作用机理和规律。研究结果将揭露重金属形态、浓度和种类对ARGs水平转移的影响规律及机理，明确重金属在ARGs水平转移过程中所扮演的角色，并通过重金属和抗生素的混合暴露对ARGs基因水平转移的影响，揭示抗生素的存在对重金属影响效应的改变。关键数据为各实验变量条件下，抗生素抗性传递发生频率的变化；细胞膜形态及细菌抗氧化系统指标的检测；质粒接合转移相关基因的定性、定量及测序结果。本项目将针对这些问题，建立重金属影响ARGs由环境复合群落向病原菌水平转移的新型实验方法，系统研究重金属对ARGs水平转移的影响因素和作用机理，并探究抗生素的存在对该水平转移过程的影响，明确重金属在ARGs水平传播中所扮演的重要角色，为有效控制和消减其负面影响提供科学依据。

重金属污染物可以促进抗生素抗性基因(ARGs)在环境中的水平转移，并可能促使ARGs从复杂的环境菌群转移至机会致病菌。本研究以环境细菌群落为供体菌，gfp标记大肠杆菌为受体菌，建立重金属影响下的接合转移实验模型，探究重金属对ARGs在微生物之间发生基因水平转移的作用及其内在机理。研究选取养猪场废水为供体菌来源，经预处理培养后获取的环境复合菌群作为实验供体菌，考察亚抑制浓度下的Cu(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)对ARGs从环境复合菌群转移至大肠杆菌的接合转移频率影响及细胞膜通透性、ROS和吲哚变化，利用二代及三代测序并结合生物信息学分析技术，进一步分析了接合过程中发生转移的质粒及ARGs的定性分析和定量检测，研究揭示Cu(Ⅱ)、Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)对ARGs从复杂环境菌群转移至大肠杆菌影响规律及机制。研究发现养猪场废水中的ARGs可向周边环境转移扩散，具有潜在的健康风险。探索了预处理方法获得可稳定培养的环境供体菌群，其宏基因组学测序分析结果表明其优势菌群为厚壁菌门和变形菌门，共占比93.3%，所含的ARGs中MDR类的种类和丰度最高。基于该供体菌群及受体菌Top10，优化了接合转移实验的反应条件，包括供受体菌比例和接合时间等。研究发现环境亚抑制浓度的Cu(II)、Cr(III)和Cr(VI)均可显著提高氨基糖苷类、多重耐药类(MDR)抗性基因从环境菌群向E. coli Top10的转移频率，其潜在机制与细胞膜通透性、ROS及细菌群体感应信号分子吲哚等相关。以MDR类ARGs为例，Cu(II)对接合转移频率的促进作用最强，表现为变化倍数最大8.07倍，其次为Cr(III)和Cr(VI)。通过接合子的基因组测序发现，Cu(II)暴露下接合子所含的I类整合子、插入序列以及基因组岛的种类均最多，高于Cr(III)、Cr(VI)暴露组和对照组，这与接合转移频率的结果相一致。接合子质粒的潜在来源宿主主要为变形菌门肠杆菌科的细菌，与受体菌有相近的生态位，表明ARGs接合转移的生态壁垒。我们的研究揭示亚抑制浓度的重金属对ARGs水平转移在分子和生态学的影响机制，为控制ARGs在环境中的传播提供科学依据。

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