猪源Mx1蛋白抑制猪瘟病毒增殖的分子机制研究

猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触传染性疾病，危害极大。虽然世界上多采用疫苗免疫来控制猪瘟的流行,但是免疫失败常有发生,因此探索新的行之有效的抗病毒策略已经成为当务之急。本研究采用PCR扩增猪源Mx1基因，原核表达后制备兔抗血清作为检测用抗体；构建重组真核表达质粒，脂质体转染后经G418筛选，建立稳定表达猪源Mx1蛋白的PK15细胞系，经RT-PCR、IFA、Western blot、激光共聚焦等技术鉴定蛋白表达效果和在细胞中的表达分布；细胞系感染CSFV Shimen株后，IFA、real-time PCR和Western blot鉴定猪源Mx1蛋白抑制猪瘟病毒增殖效果和鉴定Mx1蛋白与猪瘟病毒发生作用的基因或者蛋白；应用抗猪瘟病毒的各个蛋白的抗体及抗Mx1的兔抗血清，经激光共聚焦技术定位Mx1在细胞中抑制猪瘟病毒增殖的位置，研究抑制猪瘟病毒增殖的分子机制。

猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种高度接触传染性疾病，危害极大。Mx蛋白是由Ⅰ型干扰素(IFNα/β)诱导宿主细胞产生的一种抗病毒蛋白，具有广泛的抗病毒作用，因此我们研究了猪源Mx1蛋白抑制猪瘟增殖的分子机制，为该蛋白的临床应用奠定了基础。本研究首先应用PCR扩增到了猪源Mx1（poMx1）基因，构建了重组质粒pGEX-poMx1，经0.8 mM IPTG诱导后4 h，99kD的poMx1基因在BL21中获得高效表达，蛋白切胶后免疫Balb/c小鼠，制备了特异性抗血清，结果显示该抗血清能够与poMx1蛋白发生反应；建立了SYBR Green I 荧光定量PCR方法，检测灵敏度达到0.01 copies/μL；应用该方法定量分析了猪瘟兔化弱毒苗接种PK-15细胞后产生的内源性poMx1 mRNA，发现感染后4 h的表达量最高，然后随着时间的增长而消耗。然后将poMx1全长基因与HIV蛋白转导域（PTD）基因串联后克隆至原核表达载体pCold-Ⅰ中，经0.1mM IPTG诱导后，在大肠杆菌中以包涵体形式表达，相对分子质量为74.2kD。通过Western blot发现80μg/ml PTD-poMx1融合蛋白能够孵育Vero细胞或者PK-15细胞后，顺利入胞，通过噬斑减少试验、TCID50、FQ-PCR等分别证明入胞的PTD-poMx1融合蛋白有效抑制了水泡性口炎病毒（VSV）和CSFV的增殖，并且呈现剂量依赖性关系；通过RT-PCR和Western blot等证明了稳定表达poMx1蛋白的PK-15细胞系(PK-15/EGFP-poMx1)，直接荧光观察到融合蛋白主要在胞浆中呈现颗粒性表达。将猪瘟病毒石门株接种建立的细胞系PK-15/EGFP-poMx1后，TCID50测定、间接免疫荧光和FQ-PCR检测证明：对照组PK-15相比，细胞系感染猪瘟病毒24h、48h和72h后的收获的上清和胞内病毒滴度都有所下降；细胞系中病毒荧光斑明显减少，病毒mRNA水平明显降低。说明在PK-15细胞系中稳定表达的融合蛋白EGFP-poMx1能够抑制猪瘟病毒的复制，降低子代病毒含量。通过激光共聚焦显微镜的观察研究猪瘟病毒E2蛋白和EGFP-poMx1融合蛋白的亚细胞定位，发现两个蛋白共定位在细胞核周围。

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