一种新型耐热非特异性核酸酶的作用机制及功能进化研究

非特异性核酸酶能非特异性地降解几乎所有形式的核酸，用途广泛。来自小肠肠炎耶尔森菌的非特异性核酸酶，不仅具有非特异性，而且具有热稳定性（100℃加热20min,仍有酶活）及广泛的适用性（超级耐酸碱、耐冷热，耐化学物质），目前国内外没有关于其的相关报道。本项目将首先明确Y.e.p核酸酶的核苷酸序列，然后通过基因工程手段构建Y.e.p核酸酶高产菌株；另外本项目将阐明重组Y.e.p核酸酶的作用机制；分析Y.e.p核酸酶的耐热机制，在此基础上展开Y.e.p核酸酶的功能进化研究，期望为Y.e.p非特异性核酸酶的工业化应用提供理论基础。

来自小肠肠炎耶尔森菌的核酸酶，不仅具有非特异性，而且具有热稳定性及广泛的适用性，目前国内外没有关于其的相关报道，鉴于其广阔的应用前景和广泛的适用性，本项目对其进行了相关研究。主要内容包括： Y.e.p 非特异性核酸酶高产菌株构建；Y.e.p 非特异性核酸酶酶学性质研究；Y.e.p 非特异性核酸酶的定点突变研究。研究结果如下：（1）利用已知Y.e.e非特异性核酸酶基因（YE2923）的侧翼序列，做同源分析及蛋白质序列比对，找到保守序列，设计兼并引物，扩增出Y.e.p非特异性核酸酶片段，从而明确了Y.e.p非特异性核酸酶的核苷酸序列及氨基酸序列；（2）利用大肠杆菌原核表达系统，构建了Y.e.p非特异性核酸酶高产菌株，质粒载体pET24a转入BL21 StarTM(DE3) PlysS表达效果最好；（3）利用单因素及曲面响应法优化诱导条件，最佳条件下蛋白表达量达到 1.5 mg/mL；（4）利用Ni-NTA亲和层析柱纯化获得重组蛋白纯度大于90%；（5）通过对重组Y.e.p核酸酶酶学性质研究，确定了其最适作用温度55 ℃，最适作用pH为7.0，20mM MgCl2作为激活剂；（6）通过稳定性研究确定 MgCl2，BSA，30%及以下浓度的甘油可以作为该重组核酸酶保藏的稳定剂；且该酶的热稳定性及酸碱稳定性相当好，耐各种化学试剂（2-8mMSDS，120 mM EDTA，2-10mM的盐酸胍）；（7）对重组核酸酶的作用方式进行了研究，结果表明Y.e.p核酸酶对 dsDNA、ssDNA、λ-DNA、质粒和RNA具有降解效果，且降解率达到100%，说明此酶属于非特异性核酸酶，且同时具有内切和外切的作用方式；（8）通过对Y.e.p核酸酶的定点突变研究发现E202A，I203F，D264E这三个位点的氨基酸改变能引起酶活的变化及热稳定性变化，由此推测Glu202, Ile203 and Asp264可能是影响Y.e.p非特异性核酸酶酶活和热稳定性的关键氨基酸残基；（9）通过对Y.e.p核酸酶活性位点、盐桥和二硫键的定点突变研究，改变活性位点氨基酸、破坏盐桥和二硫键组成，发现Y.e.p非特异性核酸酶的酶活和热稳定性急剧下降，说明活性位点对维持Y.e.p核酸酶的酶活，盐桥和二硫键对维持Y.e.p核酸酶的热稳定性具有重要作用。

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