基于pH相关氨基酸定位分析的双功能木聚糖酶耐酸性突变研究

木聚糖酶用于动物饲料中可提高饲料利用率及日增重率，但是酸性环境限制了酶活性发挥，为得到低pH环境发挥活性的木聚糖酶，需要酶分子改造及探讨耐酸性机理，然而哪种、哪个位置氨基酸与pH有关？所以氨基酸定位研究特别重要。.基于氨基酸二联体含量与最适pH相关研究得到的方程“pH = 5.0－0.67*[YS]+1.22*[GR]+ 1.14*[KR] + 0.82*[MR] + 0.34*[SY]”，正相关二联体为：GR、KR、MR、SY；负相关二联体为：YS。对黑曲霉木聚糖酶定位研究，选择9个位置氨基酸突变为丝氨酸（Ser），得到负相关二联体YS，pH将向酸性环境偏移。经融合PCR定点突变，连接T-载体，转接pET20b，转化E.coli BL21（DE3），筛选并经DNA测序，IPTG诱导，纯化，检测酶性质。.结果：与野生酶pH 3.8相比，四个突变体酶pH向酸性方向偏移，其中2号、7号、9号三种纯酶pH 3.6，偏移0.2U；6号突变粗酶pH 3.4，向酸性方向偏移0.4U，位置分别为：2号（YN11S）；7号（YQ109S）；9号（YQ165S）；6号（YP76S），6号基因3’端缺失组氨酸标签，无法纯化。8号突变（YF131S）；3-7双突变（YW30S/YQ109S）因粗酶活性较低，没有纯化。pH2.6时，2号活性为最大活性48%，7号57%，9号65%，均比23号34%有较大提高，9号提高近1倍，突变酶均比野生酶pH2.6活性高，可用于饲料添加剂。.意义：1氨基酸二联体定位方程有效，可指导酶分子pH性质改造；2得到适应酸性能力更强的酶分子2/7/9/6号；3提供了理性改造酶分子pH新方案；4推测耐酸性机理为Ser参与底物结合，与Rusell rule不同“酸性氨基酸（D/E）多则其耐酸性较强，而中性或碱性氨基酸多则耐碱性较强，经序列比对、定点突变证实活性中心附近，如为酸性氨基酸则其pH则较低，如为中性，则其pH则较高”；5探讨了高通量筛选方案。.成果：发表5篇SCI文章（2篇JBC），累计因子24.4；省优秀自然科学论文奖一、二等各一项。出版《基因工程原理与实验指导》。晋升正、副教授各一人、增选为中国酶工程专业委员会委员。培养6名硕士生毕业（考取中科院、江南大学博士各1名）、1篇推荐河南省优秀硕士论文，2名在读生获首首届国家奖学金。