刚毛藻超量吸收富积铅的生理和分子生物学机制

Heavy metal pollution has caused wide public concern, and its pollution remediation also is a hot research topic. It is well documented that the bioremediation is widely adopted in the field on account of prevent the pollution. Our group has confirmed that Cladophora can accumulate Pb. However, little information is known on the molecular regulation mechanism of Pb accumulation by Cladophora. Here, the subcellular distribution and chemical forms of Pb in Cladophora will be analyzed, and the correlation with Metallothionein （MTs） ,Glutathlonee（GSH）, Phytoehelations（PCs）, and Pb accumulation in Cladophora also will be investigated, thus revealing the mechanism of Pb-resistant of Cladophora; Differently expressed quantitative proteomics and transcriptomics of Cladophora will be further explored to screen the key candidate gene(s) and the possible key metabolic regulatory networks by bioinformatical methods; It is researched to further determine the related genes about Pb accumulation and candidate genes expression by RT-PCR; The entire gene of candidate will be cloned; And then the functions of the key candidate gene(s) will be preliminarily verified by transgenic Chlamydomonas reinhardtii plants with RNAi and over expression techniques. Finally, the data will be collected from the key gene regulatory network, and then reveal the molecular mechanism of Pb hyperaccumulation by Cladophora. The result of this project not only enrich the theory on plants and heavy metals interaction, but also provides a theoretical basis for guiding Cladophora can be used to organism for the phytoremediation of heavy metal-pollution, and for breeding of hyperaccumulation plants of heavy metals.

重金属污染已引起广泛关注，其污染修复也成为研究热点，生物修复因无二次污染，被广泛采用。本项目组前期研究利用刚毛藻修复铅、锌、铜等污染，发现刚毛藻可超量富积铅，但其分子调控机制需进一步深入研究。本项目拟以刚毛藻为研究对象，研究刚毛藻铅吸收的亚细胞分布，分析铅进入刚毛藻细胞的轨迹及赋存状态与活性，研究谷胱甘肽、植物螯合素、金属硫蛋白等与铅富集之间关系，解析刚毛藻耐铅机制；分析铅不同富积状态下刚毛藻蛋白质组、转录组的差异，结合生物信息学技术解析刚毛藻铅吸收、转运相关基因调控网络，并筛选关键候选基因；利用RT-PCR研究候选基因的表达与刚毛藻铅富积的相关性；克隆基因全长；通过RNAi和过表达莱茵衣藻，验证候选基因的功能。本项目揭示刚毛藻富积铅的分子调控机制，研究结果将有助于丰富植物与重金属相互作用的理论，为应用刚毛藻吸收移除水环境重金属污染，选育重金属超积累生物提供理论依据。

（1）项目的背景.重金属污染已引起广泛关注，其污染修复也成为研究热点，生物修复因无二次污染，被广泛采用。本项目组前期研究利用刚毛藻修复铅、锌、铜等污染，发现刚毛藻可超量富积铅，但其分子调控机制需进一步深入研究。.（2）主要研究内容.本项目以刚毛藻为研究对象，研究刚毛藻铅吸收的亚细胞分布，分析铅进入刚毛藻细胞的轨迹及赋存状态与活性，研究谷胱甘肽、植物螯合素、金属硫蛋白等与铅富集之间关系，解析刚毛藻耐铅机制；分析铅不同富积状态下刚毛藻蛋白质组、转录组的差异，结合生物信息学技术解析刚毛藻铅吸收、转运相关基因调控网络，并筛选关键候选基因；利用RT-PCR研究候选基因的表达与刚毛藻铅富积的相关性；克隆基因全长；通过RNAi和过表达莱茵衣藻，验证候选基因的功能。.（3）重要结果、关键数据及其科学意义.3.1 Pb在细胞壁中的浓度最高达到2757 mg/kg。Pb在细胞壁、细胞器和液泡比例分别可达74.8%、9.11%和16.51%，刚毛藻细胞内和细胞外都可以积累Pb。.3.2 Pb通过与有机酸、蛋白质、含硫基团结合、螯合跨膜进入细胞，降低毒害。.3.3 刚毛藻中植物螯合肽在Pb吸收与解毒中发挥重要作用，细胞壁和细胞液中NPT、GSH和PCs含量随铅胁迫的增加而显著增加。这些蛋白质结合并帮助Pb2+进入细胞中。植物螯合肽吸收Pb占刚毛藻总Pb达到7.0-11.0%。巯基化合物通过形成的Pb–S–C/Pb–S在抵抗Pb2+毒性中起着最重要的作用。 .3.4 差异基因主要参与应激反应、蛋白质的生物合成，过氧化物酶体， ABC转运体、谷胱甘肽代谢等过程。.3.5 与Pb吸收相关的关键基因主要涉及两种关键转运蛋白，ABC pthr19248和ABC pthr19211；以及四种锌指蛋白。8个MT相关基因，其中植物一个PEC家族MT基因上调，2个金属硫蛋白基因上调，1个金属硫蛋白基因下调，一个酵母金属硫蛋白基因下调。.3.6 与Pb胁迫防御相关基因主要为谷胱甘肽代谢所需酶；刚毛藻氧化应激过程所需要的过氧化物酶，此外，还涉及苯丙素生物合成，植物激素信号传导以及MAPK信号通路等过程。

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