斜纹夜蛾变态发育期蜕皮激素受体(EcR/USP)互作蛋白的分离鉴定与功能分析

昆虫变态发育主要受到蜕皮激素（20E）的调控。EcR作为20E的受体通常与USP形成异源二聚体，共同传导20E信号。蜕皮激素受体本身是如何被调控的，目前尚缺乏系统的研究。在本研究中，我们以一种重要鳞翅目害虫——斜纹夜蛾为研究对象，构建了酵母双杂交文库。通过筛选得到114个互作蛋白，其中与EcRB1，USP1和USP2互作的蛋白分别有28，54和32个，未筛选到与EcRA互作的蛋白。我们从中挑选了7种蛋白，包括Hsp70、Hsc70、DnaJ-5（热激蛋白40），MBF2，polyubiquitin， esr16和NEDD8-like，利用酵母双杂交的方法进一步验证了蛋白间的互作关系。结果表明，除NEDD8-like外，其余6种均为阳性互作蛋白。Far-western 和Pull-down试验进一步表明，Hsp70和Hsc70均分别与EcRA、EcRB1、USP1和USP2互作；Hsp/Hsc70 C-末端的“EEVD”结构域是其与USP互作的关键位点。此外， USP1的“DBD”结构域和EcR的“LBD”结构域负责与Hsp/Hsc70互作。在细胞中干扰Hsc70，对EcR的表达没有影响，但20E下游基因如E74B, E75的表达却受到显著的抑制。这意味着热激蛋白分子伴侣在蜕皮激素受体调控中起重要作用。此外，研究还发现EcRB1和USP1具有相似的表达谱，而EcRA和USP2的转录表达也高度相似，这意味着EcRB1/USP1和EcRA/USP2可能是虫体内两种不同的二聚体组合形式。荧光素酶活性分析表明，除EcRA/USP2组合外，EcRA/USP1, EcRB1/USP1, EcRB1/USP2都具有显著的转录激活活性，并且EcRB1/USP1的转录激活活性最强。在20E存在情况下，USP1可以显著增加EcRB1在细胞核中的聚集，而USP2则可以使得EcRB1从细胞核向细胞质中转移。这意味着EcRB1/USP1是变态发育过程中起主要作用的异源二聚体组成形式。上述结果说明，热激蛋白分子伴侣和USP通过与EcR互作，影响EcR的亚细胞定位，从而对EcR的功能产生调控。该研究对进一步完善蜕皮激素信号传导的机理，揭示昆虫变态发育的分子机制具有重要理论意义。此外，本研究还鉴定出了许多与EcR和USP互作的蛋白，这些蛋白质的功能值得进一步深入研究。