HIV-1 Tat蛋白损伤视网膜色素上皮细胞的microRNA组学研究

艾滋病目前已成为严重威胁人类健康和社会稳定发展的重要感染性疾病之一，成年患者中有50%～75%会出现严重的眼科并发症，但发生机制不清。HIV-1 Tat是HIV-1基因组编码的关键性调控蛋白，能够直接或间接导致了各种AIDS的并发症，申请者前期研究发现HIV-1 Tat蛋白可以诱导RPE凋亡，破坏RPE屏障功能，但具体分子机制尚需进一步研究。微小RNA（miRNA）在转录后水平调控基因表达，影响生物体的生理和病理变化。因此本课题拟建立HIV-1 Tat损伤RPE细胞的miRNA表达谱，筛选影响HIV-1 Tat损伤作用的RPE特异性miRNA，用生物信息学预测和分子生物学验证相结合的方法，确定其靶基因，并研究RPE特异性miRNA的功能及其作用机制，为从基因调控水平揭示HIV-1侵犯血-视网膜屏障的可能机制，深入研究HIV-1眼部侵犯与相关并发症的发生机理及临床防治策略提供科学的实验依据。

HIV-1 Tat是HIV转录和复制所必须，具有旁分泌、免疫抑制及内化等多方面的效用，直接或间接导致了各种AIDS的并发症，本课题组前期曾发现HIV-1 Tat蛋白可以诱导视网色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE） D407细胞系凋亡，并通过调节紧密连接相关蛋白的表达，破坏细胞屏障，并推测这可能是其侵犯眼部的机制之一。在本研究中我们首先使用另一人RPE细胞系ARPE-19对HIV-1 Tat的RPE细胞毒性作用进行了确认。为进一步明确其具体分子机制，我们使用基于miRBase 16.0数据库的Exiqon miRCURY LNA™ microRNA芯片检测了不同浓度（100、200、400nM）HIV-1 Tat蛋白处理后D407细胞 miRNA表达谱的变化。结果显示在芯片所含的1869种已知的miRNA中，三种浓度分别引起了343、420、378个miRNA的变化。通过聚类分析发现mir-520d、mir-625-3p、mir-146b-3p、mir-31随HIV-1 Tat 蛋白浓度的升高呈现逐渐降低的趋势，mir-101、mir-508-5p、mir-1290则逐渐升高，这一趋势在D407和ARPE-19细胞系中均用qPCR进行了证实。使用TargetScan Human5.2对差异miRNA进行分析发现mir-625-3p与PUMA、 mir-101与GJA1之间可能存在调控关系，相应的luciferase reporter assay也证实了这些调控关系。与单独Tat处理相比，D407和ARPE-19细胞预先转染miR-101抑制剂后再行Tat处理，经上皮电阻明显增加，荧光素钠渗露明显减少；预先转染miR-625类似物后再行Tat处理，细胞凋亡明显减少。表明miRNA水平变化能够明显影响HIV-1 Tat的细胞毒性作用。因此，miRNA作为转录后水平的调节因子参与了HIV-1 Tat对RPE的破坏作用，这一发现有望为AIDS相关眼病的治疗提供新的思路和靶点。

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