DBR2基因超表达与胞内ROS协同作用对青蒿素生物合成的影响

Increasing of the artemisinin content in Artemisia annua L. is a hot topic in the field of plant secondary metabolic engineering. And the key factors involved in low content of artemisinin may be the accumulation and efficient transformation of dihydroartemisinic acid (DHAA) to artemisinin. A research had demonstrated that DBR2, coding Δ11 (13) double bond reductase gene, can promote the biosynthesis of DHAA when it expressed in saccharomycetes, however, no transgenic A. annua plants with DBR2 gene has obtained by now. In this research, overexpression vector and gene silence vector with DBR2 gene were constructed and transformed into A. annua, through which the influence of DBR2 gene on the biosynthesis of artemisinin and its precursor DHAA was researched and the function of DBR2 in transgenic plants was demonstrated. DHAA can be transformed into artemisinin depending on the intercellular ROS burst. In this research, DMSO was used to promote the overexpression of DBR2 gene in A. annua plants. DAB and spectrum method were used to detect the intercellular ROS, and qPCR was performed to analyze the expression level of the key genes. Besides, the dynamic variations of DHAA and artemisinin were tested, which can be provided as a theoretical basis for the ROS function on transforming DHAA into artemisinin. The research on the cooperative effect of overexpression of DBR2 gene and intercellular ROS on artemisinin biosynthesis can provide a new idea for the metabolic engineering of artemisinin biosynthesis.

提高青蒿中青蒿素含量是植物次生代谢研究领域热点之一。导致青蒿素含量低的两个重要因素可能是二氢青蒿酸（DHAA）的积累水平及其转化为青蒿素的效率。青蒿醛Δ11(13)双键还原酶（DBR2）基因在酵母中得到初步验证，证实DHAA合成依赖于DBR2表达，然而DBR2基因功能缺乏转基因证据。本研究构建DBR2基因超表达及基因沉默载体转化青蒿，考察DBR2基因对青蒿素及其前体DHAA生物合成的影响，在转基因植株中直接明确DBR2基因的功能；DHAA转化为青蒿素依赖于胞内活性氧物质（ROS）的生成，本研究采用DMSO刺激DHAA含量高的超表达DBR2株系，运用DAB法及光谱法测定胞内ROS，qPCR定量分析关键基因的表达，检测DHAA与青蒿素含量的动态变化，明确胞内ROS对DHAA转化为青蒿素的作用。本研究探讨超表达DBR2基因与胞内ROS的协同作用对青蒿素合成的影响，为青蒿素的代谢工程提供了新思路。

疟疾是一种严重的流行性疾病，在发展中国家每年超过 100 万人因患疟疾而死亡。然而青蒿中青蒿素的含量低，采用代谢工程策略能够有效提高青蒿中青蒿素的含量。本研究以青蒿DBR2基因为主要研究对象，得到如下研究成果。.1. MeJA能够有效促进青蒿素生物合成途径4个基因如的ADS、CYP71AV1、DBR2和ALDH1的表达；两个与调控青蒿素代谢的转录因子ORA和ERF1的表达量也增强。在MeJA处理青蒿48 h后，青蒿中青蒿素的含量较对照提高了1.16倍。结果证实MeJA可以诱导青蒿素生物合成相关基因和转录因子上调，从而导致青蒿素含量增加。.在本研究中获得7个独立的超表达DBR2转基因植株；HPLC检测超表达DBR2转基因植株中青蒿素及其直接前体二氢青蒿酸较对照显著提高。值得注意的是，在转基因植株中青蒿素合成途径支路上的代谢产物青蒿素B及其直接前体青蒿酸的含量也得到大幅提高。可能的解释是二氢青蒿酸可以作为青蒿酸的前体，在超表达DBR2植株中可以提高青蒿酸含量。在4株DBR2沉默植株中，青蒿素及其前体二氢青蒿酸的含量降低，转基因结果证实了DBR2可作为培育高产青蒿素基因工程靶基因。采用DMSO处理超表达DBR2植株发现，青蒿素的含量得到进一步提高，说明ROS的爆发能够促进二氢青蒿酸转化为青蒿素。.实时定量PCR中内参基因的选择和稳定验证是十分必要的，然而在青蒿中目前并未对内参基因的稳定性进行评估。在本研究中，10个看家基因采用geNorm和NormFinder软件进行评估。结果显示RPⅡ & EF1α能够作为稳定的内参进行组织表达谱分析，EF1α & TUB 可推荐作为研究激素处理后基因表达差异分析的内参基因，而ACT & EF1α在温度胁迫的样本中保持最高的稳定性。该研究成果为在不同条件下分析青蒿素合成途径相关基因的表达提供了可靠稳定的内参基因。.隔夜霜冻能够提高青蒿素含量，然而其分子机制尚不清楚。在本研究中我们发现外源MeJA能够有效提高青蒿幼苗抗冻性。同时在低温胁迫中青蒿中，JA生物合成途径关键酶基因都能够受到低温诱导，导致内源性JA水平升高。内源性JA水平的增加导致3个转录因子ERF1，ERF2和ORA表达水平上调，转录因子激活了青蒿素生物合成途径基因DBR2等基因水平的上调，最终导致了青蒿素及其相关代谢产物含量的增加。

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