TAP26磷酸化调控SP-B基因表达的研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
81070059
项目类别：
面上项目
资助金额：
32.0万
负责人：
柴新群
依托单位：
华中科技大学
学科分类：
H0109.急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征
结题年份：
2013
批准年份：
2010
项目状态：
已结题
起止时间：
2011-01-01 至2013-12-31

项目参与者：
邓飞涛；高金波；帅晓明；叶伦；陈俊华；胡志坚；柏立山；李彦旭；
关键词：
TTF-1 EMSA Directed SP-B TAP26 Mutagenesis Site

项目摘要

人肺表面活性蛋白B( SP-B)是调节肺器官分化、降低肺泡表面活性张力的重要蛋白质。急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的发病机制复杂，有关特异性肺表面活性蛋白在ARDS发病及治疗中的作用已成为新的研究热点。研究表明： TTF-1相关蛋白26 （TAP26）能与TTF-1形成蛋白复合物共同促进SP-B基因表达。我们前期研究发现：TAP26核定位信号位点S66消失将明显影响其对SP-B基因的调控。本课题拟采用定点诱变、细胞共转染、ChIP及EMSA等技术，探讨TAP26磷酸化对SP-B基因表达的影响, 揭示TAP26、TTF-1对SP-B基因调控的分子机制；同时运用免疫组化双染色、Western blot、Real-time PCR等方法定性及定量研究ARDS模型鼠肺组织细胞中TAP26、TTF-1及SP-B的分布情况，为揭示SP-B基因在ARDS发病机制中的作用并探索新的治疗策略提供理论依据。

结项摘要

摘要：.背景：人肺表面活性蛋白B( SP-B)是调节肺器官分化、降低肺泡表面活性张力的重要蛋白质。急性呼吸窘迫综合征（ARDS）肺表面活性蛋白（SPs）功能严重受损，提示肺泡上皮细胞损伤导致的内源性肺泡表面活性蛋白代谢异常、缺乏可能是重要原因，有关特异性肺表面活性蛋白在ARDS发病及治疗中的作用已成为新的研究热点。研究表明： TTF-1相关蛋白26 （TAP26）能与TTF-1形成蛋白复合物共同促进SP-B基因表达。我们前期研究发现：TAP26核定位信号位点S66消失将明显影响其对SP-B基因的调控。.方向：本课题将在前期研究结果和合理构思的基础上，观测核蛋白TAP26磷酸化位点突变体对TTF-1在细胞内定位、与TTF-1相互作用及其对SP-B基因表达调控作用的影响。并且初步定量及定性分析ARDS死亡大鼠模型肺组织中TAP26、TTF-1和SP-B在肺泡Ⅱ型细胞核内的分布情况，并与正常肺组织进行比较。.主要内容：（1）TAP26磷酸化位点突变体的构建及条件优化；（2）TAP26双重磷酸化位点突变体的构建及条件优化；（3）明确TAP26对SP-B基因表达起关键作用的磷酸化位点；（4）明确TAP26关键的磷酸化位点突变体与TTF-1相互作用形成复合物的影响。.重要结果：（1）运用体外细胞共转染和荧光素酶报告基因检测技术等方法，找到TAP26关键的磷酸化位点为S66。（2）结果发现：在转染的H441细胞，突变体TAP26(S66→A66)对hSP-B启动子活性没有促进作用（P<0.05）。（3）通过实验得出：TAP26核定位信号S66位点的消失，将影响TAP26与TTF-1形成复合物，从而不能与TTF-1相互作用促进hSP-B启动子活性。于是推测：TAP26的S66PKC磷酸化位点是TAP26能够易位到细胞核，从而能与TTF-1相互作用以促进hSP-B转录的重要部位。.科学意义：加强对SP-B基因表达调控机制的研究并初步探索SP-B基因在ARDS发病机制中的作用将有助于我们寻找出对ARDS发病机制及治疗研究中起特异作用的基因，为揭示SP-B基因在ARDS发病机制中的作用并探索新的治疗策略提供理论依据，具有重要经济及社会价值。