新型靶向GEBP11/GX1花菁荧光分子探针的构建及其胃癌在体成像研究

Cyanine dyes have found widespread use as fluorescent lables for biomolecules. The appeal of this class of probes derives from their broad wavelength tunability, little steric hindrance, good nuclear membrane permeability and little toxicity. However, some drawbacks in the biomedical labeling use of cyanine dyes are also known. For example, the number of these available as probes limited at present, poor photostability, low fluorescence quantum yields and so on. Therefore, we propose novel penta-/ hepta-methine cyanine dyes with larger conjugated system by symmetric synthesis method. Based on the succinimide actived carboxyl groups, the cyanine dyes are conjugated with the vascular- endothelial- cell-specific binding peptide GEBP11/GX1 in gastric cancer. The main purpose of the study is screening out high fluorescence quantum yields, photostability, nuclear membrane permeability, little toxicity and high targeted fluorescence probes. The GEBP11-dye/GX1-dye targted probes are applied on SGC7901-luc nude mouse model for in vivo monitoring through FMT/BLT optical molecular imaging technology. A further objective of this study is to investigate the changes and tissue distribution of GEBP11-dye，GX1-dye and luciferase in vivo, and to establishing a visual diagnosis method for gastric cancer in living subjects. The research will provide potential new method for diagnosis and therapy in cancer.

花菁染料因具有波长可调范围广、立体位阻小、膜通透力强、毒性小的优点，是一类理想的活体标记荧光探针。然而，目前应用于生物学标记的花菁染料还存在种类有限、稳定性差、荧光量子产率低等缺点。本项目拟通过对称合成法，合成新型大共轭结构五甲川和七甲川花菁染料，并通过琥珀酰亚胺活化羧基，以实现与胃癌血管靶向肽GEBP11/GX1之间的高度交联，从而制备并筛选出量子产率高、光稳定性强、毒性小、膜通透力强以及高度靶向性的胃癌靶向荧光分子探针GEBP11-dye、GX1-dye。在此基础上，以SGC7901-luciferase细胞为细胞系，建立胃癌裸鼠移植瘤模型，利用自主知识产权的FMT/BLT分子影像平台，动态观察并对比GEBP11-dye/GX1-dye在胃癌组织中的活动变化及组织分布，以此建立一种新的胃癌在体检测可视化方法。本项目的完成将为胃癌的发生发展机制及靶向诊治提供新方法。

花菁染料具有分子量小、毒性低、波长可调范围广、以及摩尔消光系数大等优点，使其广泛的用于荧光标记领域。但是，目前花菁染料存在种类有限、光稳定较差、荧光量子产率低、合成路线复杂、副产物多、难纯化进而导致价格昂贵、在肿瘤荧光分子成像研究中可用品种甚少，进而阻碍了其在荧光分子成像肿瘤研究中的应用等缺点。本课题组采用对称合成方法和一步法，制备得到一系列新型中位带活性羧基的对称型五甲川花菁染料CyIC，此合成路线步骤更简便、产率高、易于分离提纯，简化了操作流程，降低了荧光染料的成本。新型五甲川花菁染料具有毒性小、光稳定性强、具有膜穿透性以及生物活性等优点，紫外最大吸收峰在634-644nm，荧光发射峰在665-675nm。与商品级染料Cy5.5相比较，染料CyIC具有良好的光稳定性。. 构建了一类具有胃癌血管靶向特异性的新型荧光分子探针，利用荧光分子成像对胃癌的靶向监测进行了相关研究。选择具有良好生物亲和力和特异性的胃癌血管特异性短肽 GX1 作为胃癌特异性分子标志物，将自行所合成的新型五甲川花菁染料CyIC与其共价偶联，制备成具有胃癌特异靶向能力的CyIC-GX1荧光分子探针，通过体内外荧光成像实验发现所合成的探针具有很好的胃癌肿瘤靶向能力，说明所构建的新型五甲川花菁染料可用于荧光成像研究领域，扩大了荧光标记物的可选择性以及GX1具有非常好的肿瘤血管靶向能力，其可以作为胃癌的特异性标记物，开展相关的胃癌诊断研究，具有向临床转化的潜能。. 胃癌血管内皮细胞特异性结合短肽GEBP11为环状9肽（其氨基酸序列为CTKNSYLMC），它能特异地结合于移植瘤组织血管、人胃癌血管及共培养内皮细胞，在胃癌血管生成中发挥着重要功能。但是基于前期研究发现胃癌靶向探针CyIC-GEBP11在活体循环时间较长后才能在肿瘤组织达到最大聚集量，随后荧光强度逐渐开始减弱；再由于常用的近红外有机染料其价格昂贵并稳定性较差，从而造成荧光染料和有效检测时间的双重浪费。我们基于高效快速的点击化学反应，构建了针对肿瘤特异性荧光探针Tz-FL / TCO-TL。点击化学介导的胃癌靶向分子探针TCO-GEBP11/Tz-Cy5.5在活细胞标记及活体肿瘤成像中表现出优越的性能，能高效快速结合于肿瘤部位，有效提高探针的检测灵敏度和靶向性，延长探针在活体肿瘤组织的寿命和检测时间。

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