基于甜味受体的天然甜味物质的高通量筛选方法的构建与应用

In modern society, obesity, diabetes is becoming more and more popular, high intake of high-calorie sweeteners in the diet is one of the important reasons causing these diseases. Thus screening and developing of the sweetener with non-caloric, low-calorie, no adverse effects on the human body and a good taste, has become an inevitable trend in the development of the sweetener. However, at present China only has developed little natural sweet substances and the lack of high-throughput screening methods is an important bottleneck. This project arms to construct and screen sweet taste receptor functionally and stably expression cell line, which is formed by transferring genes of both encoding human gene sweet taste receptors subunit (T1R2+T1R3) and the G protein signaling molecules downstream of the receptor subunit into the recipient cell by lentivirus. This kind of cell line can combine sweet substances and stimulate downstream signaling pathway, releasing of intracellular calcium , thus the detection of intracellular calcium influx is easy to recognize sweet substances in large-scale . Meanwhile, the high-throughput in vitro toxicology methods will be established to evaluate the safety of sweet substances. On this basis, screening and isolation about five kinds of low-calorie and safer natural sweetness ingredients from Yunnan plant repository will be done. This project will lay the foundation for the development of high-throughput screening methods of sweeteners and has good application prospect; while mining and utilization of Yunnan's rich plant resources to develop more safe natural sweeteners, has practical significance to control the obesity, diabetes and other disease related to high energetic sweeteners intake.

饮食中高热量甜味剂的大量摄入是导致现代社会流行肥胖、糖尿病的重要原因之一。因而筛选和开发低热量、对人体无不良影响、良好味觉的甜味剂，成了当前甜味剂发展的必然趋势。目前我国自行开发的天然甜味物质种类甚少，缺乏高通量筛选手段是其重要瓶颈之一。本项目拟将编码人甜味受体T1R2和T1R3的基因，以及下游G蛋白信号分子基因通过慢病毒转入受体细胞中，筛选出一种能稳定表达甜味受体的细胞系，甜味受体结合甜味物质后，能激发下游信号通路使细胞内钙离子释放，因而通过检测细胞内钙流变化即可实现甜味物质的高通量识别。同时，建立高通量体外毒理学方法对甜味物质的安全性进行评价。在此基础上，从云南植物资源库中筛选和分离鉴定约5种安全的天然甜味成分。本项目将为开发甜味物质高通量筛选技术打下基础，具有较好应用前景；同时挖掘和利用云南丰富的植物资源，开发更多安全的天然甜味剂，将对肥胖、糖尿病等疾病的控制具有现实意义。

甜味剂是人们日常生活所必须的调味品之一，也是添加剂工业中产量比重最大的种类。虽然中国具有丰富的植物资源，但是目前我国自行开发的天然甜味物质种类甚少，缺乏高通量筛选手段是其重要瓶颈之一。本项目根据中国人群甜味受体基因的主体单倍型，将甜味物质识别所必须的T1R2、T1R3和Gα16三个基因分别克隆入带有Tet on系统的表达载体中，然后使用慢病毒转入HEK293细胞中，筛选出了能够同时稳定表达三个基因的细胞克隆。Q-PCR检测结果显示，所构建的甜味受体中三个目的基因的表达水平都显著上调。通过Western Blot法检测到了三个目的基因的蛋白在细胞中均有表达。项目使用已知甜味剂（蔗糖和糖精）对构建的甜味受体细胞进行了钙流测定。结果显示所构建的甜味受体细胞可引起已知甜味剂处理后的钙离子浓度变化，并制出了蔗糖的拟合反应曲线。实验结果表明：项目构建的甜味受体细胞具备对不同浓度的甜味剂的分辨能力，结合钙离子荧光成像技术，初步实现对甜味物质的高通量筛选。本项目采用用构建的甜味受体细胞模型，对云南20种特色甜味植物的提取物进行了钙流测定，筛选出了具有甜味反应的假秦艽、神秘果、野槟榔、多穗柯、罗汉果5种天然植物。进一步的感官评价结果显示，筛选出的5种天然植物提取物在所检测的20种植物中具有较高的甜度。项目进一步对筛选出的5种植物中甜度最高的假秦艽提取物进行了单体成分的分离和结构鉴定，从中分离得到33个单体化合物，其中有 9个结构新颖的化合物。分离到的33个单体化合物在钙流测定中反应不明显，原因有待进一步研究。此外，假秦艽提取物在卷烟中得到初步应用，用于提升产品的甜韵感和回甘味，其他应用有待于进一步开发。本项目通过现代分子生物学与细胞生物学手段，为甜味物质高通量筛选新技术的研发打下了基础，同时，挖掘了云南丰富的植物资源来筛选和开发更多安全的天然甜味剂，具有重大的应用前景。

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